快速溶剂萃取法在灵芝多糖提取中的应用

王宇晴，牛雯颖，刘松梅*，郑春英*

(1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 生命科学学院 黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080)

灵芝(Ganodermalucidum)，著名的食药用真菌[1]，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等作用[2-5]，有着悠久的应用历史[6]。随着科技水平的提高，各种生产技术的应用，使得灵芝产量不断增加，现已不仅能满足于药品、功能性保健食品的生产[7]，还可作为基料被制作成各种功能性复合调味品，如灵芝酱油、灵芝醋等，深受广大消费者喜爱[8]。

灵芝的主要活性成分为多糖、三萜、生物碱、芳香类成分等[9]，其中的研究热点是多糖成分。关于多糖的提取，目前应用较多的是热水提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶法、高压热水提取法等[10-13]，上述方法存在着耗时、溶剂消耗大、提取率低等缺点。快速溶剂萃取法具有自动化程度高、溶剂用量少、耗时短的特点，现已在食品安全检测领域得到广泛的应用[14]。

本文采用快速溶剂萃取法对市售灵芝子实体中多糖成分进行提取，并采用高效毛细管电泳法对其进行单糖组分分析，为功能性复合调味品中灵芝多糖的快速提取及分析提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

灵芝样品：购于哈尔滨人民同泰药店，经黑龙江大学生命科学学院郑春英教授鉴定为灵芝(Ganodermalucidum)。

样品脱脂处理：脱脂溶剂为95%乙醇，料液比1∶8，回流2 h，弃去滤液，烘干药渣，即得脱脂供试品，备用。

PMP：分析纯，天津市光复精细化工研究所；葡萄糖：供含量测定用，纯度>99.8%，Amresco；甘露糖、半乳糖、木糖对照品：均购自Sigma公司，纯度为99%；其他试剂：均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

P/N 10503 型 美国Applied Separations公司；1229-HPCE高效毛细管电泳仪 北京新技术应用研究所；25 μm×42 cm石英毛细管柱 河北永年光学纤维厂。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量的测定

采用蒽酮-硫酸法[15]。葡萄糖对照品标准曲线的绘制参阅文献[16]。

1.2.2 单因素试验

ASE各影响因素的选择及设定参阅文献[17]。

1.2.2.1 ASE萃取温度的筛选

精密称取1.1.1项下脱脂样品3.0000 g，置于ASE萃取池中，设定ASE的提取压力为90 Pa，提取时间为20 min，循环次数为2次，在不同温度下，制备多糖萃取液，合并萃取液，采用1.2.1项的方法测定多糖含量。

1.2.2.2 ASE萃取压力的筛选

精密称取1.1.1项下脱脂样品3.0000 g，置于ASE萃取池中，设定ASE的提取时间为20 min，循环次数为2次，提取温度为100 ℃，在不同压力下，制备多糖萃取液，合并萃取液，以下步骤同1.2.2.1。

1.2.2.3 ASE萃取时间的筛选

精密称取1.1.1项下脱脂样品3.0000 g，置于ASE萃取池中，设定ASE的提取压力为90 Pa，循环次数为2次，提取温度100 ℃，根据不同的提取时间，制备多糖萃取液，将合并萃取液，以下步骤同1.2.2.1。

1.2.2.4 ASE循环次数的筛选

精密称取灵芝脱脂样品3.0000 g，置于ASE萃取池中，设定ASE的提取压力为90 Pa，提取时间为20 min，提取温度为100 ℃，根据不同的循环次数制备多糖萃取液，合并萃取液，以下步骤同1.2.2.1。

1.2.3 正交试验

在单因素试验基础上，确定正交试验的影响因素，按照L9(34)正交表安排试验，因素水平表见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.4 验证试验

采用所筛选出的最佳提取条件对灵芝脱脂样品中的多糖成分进行提取，并与传统热回流提取法进行对比分析。

1.2.5 灵芝多糖中的单糖组成分析

灵芝多糖的水解及衍生化参阅文献[18]。单糖组成分析参阅文献[19]，采用高效毛细管电泳法。电泳条件：毛细管柱(25 μm×42 cm)；检测波长：254 nm；pH为9.5的80 mmol/L硼砂缓冲体系；分离电压为18 kV；进样时间为25 s。

分别精密称取1.1.1项下4种单糖对照品各100 mg，以水制成10 mg/mL的4种单糖对照品液，备用。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制结果

根据分析测定结果计算葡萄糖对照品线性方程为：Y=7.4450X-0.0061， r=0.9999。说明葡萄糖对照品在0.02～0.10 mg/mL与吸光值呈现良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 ASE萃取温度的筛选结果

设定不同的ASE萃取温度，测定不同的萃取温度下灵芝多糖含量的动态变化，结果见图1。

图1 不同ASE萃取温度对灵芝多糖含量的影响Fig.1 Effect of different ASE extraction temperatures on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图1可知，随着ASE萃取温度的增加，灵芝多糖的提取率也随之增加，当萃取温度达到110 ℃时灵芝多糖含量达到最大，再增加萃取温度，其对提取率的影响并不显著，上述结果表明，随着萃取温度的增高，有助于灵芝多糖的溶出，但温度过高也可导致多糖的降解，因此，ASE的最佳萃取温度为110 ℃。

2.2.2 ASE萃取压力的筛选结果

ASE萃取压力是影响灵芝多糖含量的一个重要因素，设定不同的ASE萃取压力，测定不同的萃取压力下灵芝多糖含量的动态变化，结果见图2。

图2 不同ASE萃取压力对灵芝多糖含量的影响Fig.2 Effect of different ASE extraction pressures on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图2可知，随着萃取压力的增加，灵芝多糖的含量也随之增长，当达到100 Pa时，灵芝多糖的提取率达到最高值，继续增加萃取压力，灵芝多糖的含量则出现下降的趋势，这可能是由于压力的加大，促进了多糖的分解。因此，最佳萃取压力设定为100 Pa。

2.2.3 ASE萃取时间的筛选结果

分别测定不同ASE萃取时间对灵芝多糖含量的影响，结果见图3。

图3 不同ASE萃取时间对灵芝多糖含量的影响Fig.3 Effect of different ASE extraction time on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图3可知，随着ASE萃取时间的增长，灵芝多糖的含量也随之增长，在20 min后增长趋势逐渐减缓，这是由于萃取液中多糖含量趋于平衡，继续延长萃取时间对多糖含量的影响不明显，并且时间的延长还可导致多糖降解，故选择萃取时间为20 min。

2.2.4 ASE循环次数的筛选结果

设定不同的ASE循环次数，测定其对灵芝多糖含量的影响，结果见图4。

图4 不同ASE循环次数对灵芝多糖含量的影响Fig.4 Effect of different ASE cycle times on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图4可知，随着循环次数的增加，灵芝多糖的提取率增长并不明显，从而说明循环次数不是灵芝多糖提取过程中的主要影响因素。并且，多次循环萃取，不仅使提取时间延长，还可能导致多糖的降解，故设定ASE循环次数为2次。

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，确定ASE对灵芝多糖含量的影响因素为：温度、压力及时间，采用正交试验法筛选灵芝多糖的最佳工艺参数，结果见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

续 表

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiment

由表2和表3可知，ASE提取灵芝多糖的最佳工艺条件为A3B1C3，即：ASE提取温度设定为110 ℃，压力选择90 Pa，提取时间为25 min。说明ASE的温度对灵芝多糖含量的影响极显著，而ASE萃取时间和压力对灵芝多糖含量的影响不显著。综合多种影响因素，最终确定灵芝多糖最佳ASE提取条件为：温度设定为110 ℃，压力设置为90 Pa，提取时间为20 min，循环次数为2次。

2.4 验证试验结果

分别采用传统热水提取法及所筛选的最佳ASE提取条件对灵芝中多糖进行提取，结果见表4。

表4 不同提取方法比较结果(n=3)Table 4 Comparison results of different extraction methods(n=3)

由表4可知，按照单因素试验及正交试验结果所筛选的ASE提取工艺提取灵芝多糖，其含量与传统热水提取法相比有显著提高，并且，其提取率与正交试验中7号试验结果相近，从而验证了结果的准确性。

2.5 灵芝多糖中的单糖组成分析结果

按1.2.5制备衍生化对照品混合溶液，采用HPCE法进样，测定峰面积，绘制标准曲线，结果见表5。

表5 标准曲线测定结果Table 5 Determination results of standard curves

对所提取得到的灵芝多糖中单糖组分进行高效毛细管电泳分析，结果见图5。

图5 高效毛细管电泳分析结果Fig.5 Analysis results of HPCE

注：1为PMP；2为木糖；3为葡萄糖；4为甘露糖；5为半乳糖。

由图5可知，对比混合对照品，根据其出峰时间，可以确定：灵芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成，未检测到木糖。经计算，灵芝多糖中单糖组成比例为葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖为2.8063∶1.0000∶2.1910。

3 结论

灵芝子实体细胞壁结构致密，采用ASE法提取灵芝中多糖成分，借助其高温、高压、高效、自动化、无噪音等特点，与常用的灵芝多糖提取法相比，其提取率显著提高。结果表明，采用ASE法提取灵芝多糖成分的最佳条件为提取温度为110 ℃，压力90 Pa，提取时间20 min，循环次数2次。

通常，各种功能性复合灵芝调味品在制作过程中会发生一系列的多糖降解，使得调味品中的灵芝多糖难富集、含量低；且构成多糖的单糖组分及其含量与多糖的结构、溶解性等都密切相关。本文采用ASE法可快速、高效提取灵芝多糖，同时采用HPCE法分析灵芝多糖中的单糖组成，方法成熟、灵敏度高、重现性好，因此，ASE-HPCE法适用于各种调味品中灵芝多糖的快速提取及分析检测。