氧化苦参碱对过氧化氢刺激的胰腺腺泡细胞高迁移率族蛋白B1表达和释放的影响

李仁礼 向晓辉 周子栋 张文成 夏时海

1武警后勤学院，天津 300309；2武警特色医学中心消化疾病研究所，天津 300162；3天津市肝脏胰腺纤维化与分子诊疗重点实验室，天津 300162

急性胰腺炎(AP)是由多种病因引起的胰腺的一种炎症状态，胰腺腺泡细胞受损和胰蛋白酶原的激活是AP发生的最初病理生理过程[1-2]，其中细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)与抗氧化系统失衡是胰腺腺泡细胞受损的主要因素[3]。活性氧主要包括单态氧(O)、超氧化物(O2-)、羟基(OH-)和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)等[3-4]。研究发现高浓度H2O2可引起细胞氧化应激损伤甚至坏死，伴随相关应激蛋白表达增加[5]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)是一种高度保守的核蛋白，作为DNA伴侣蛋白参与DNA复制、重组、转录和修复，而细胞外的HMGB1作为一种损伤相关分子模式参与炎症和免疫反应，在多种疾病中发挥着复杂的病理生理功能[6-10]。然而H2O2在胰腺腺泡细胞HMGB1表达和释放过程中的作用机制尚不清楚。氧化苦参碱(oxymatrine, OM)是从苦参中提取出的一种生物碱，具有抗炎、抗病毒、抗纤维化等药理作用[11]。本课题组前期研究证实OM能抑制脂多糖诱导的胰腺腺泡AR42J细胞的炎症反应[12]。本研究观察OM对H2O2刺激后AR42J细胞HMGB1表达和分泌的影响，探讨HMGB1在AP发病机制中的作用。

材料与方法

一、H2O2作用于AR42J细胞的最佳浓度选择

AR42J细胞购于ATCC库(American type culture collection)，常规培养、传代。采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率。取对数生长期细胞，常规消化后制成细胞悬液，以5×103个/孔接种于96孔板培养24 h，更换终浓度分别为0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2的培养液，每个浓度设置3个复孔，孵育24 h后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)继续培养4 h后，弃培养液，每孔加入150 μl的二甲基亚砜，震荡10 min，酶联免疫检测仪测定波长490 nm处的吸光值(A490值)，绘制细胞生长曲线，确定H2O2作用于AR42J细胞的最佳浓度。

二、AR42J细胞分组与干预

取对数生长期AR42J细胞，以1.0×106个/孔接种于6孔培养板，随机分为对照组、H2O2组、H2O2+OM组。H2O2组及H2O2+OM组加入等容积的H2O2(H2O2最佳浓度)，对照组加入等容积的三蒸水，H2O2+OM组在加入H2O2前0.5 h加入OM(终浓度0.5 g/L[12])，培养 24 h后收集细胞及细胞培养上清液。

三、AR42J细胞HMGB1蛋白表达量检测

应用RIPA蛋白裂解液抽提细胞总蛋白， BCA法定量蛋白，行常规蛋白质印迹法检测细胞HMGB1蛋白表达水平，以GAPDH作为内参。GAPDH抗体(1∶1 000)、HMGB1抗体(1∶1 000)均购自美国Proteintech公司，HRP标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)、ECL发光液均购自北京Solarbio公司。应用Image J软件扫描条带，以目的条带与GAPDH条带灰度值比作为蛋白表达量。

四、AR42J细胞上清液HMGB1蛋白水平检测

收集6孔板中各组细胞培养液，3 000 r/min离心20 min，离心半径5 cm。收集上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中的HMGB1水平。HMGB1酶联免疫检测试剂盒购自南京建成生物工程有限公司，按说明书操作。使用ELISAcalc软件绘制标准曲线，计算样品浓度。

五、AR42J细胞内HMGB1蛋白定位检测

采用免疫荧光法检测HMGB1在细胞内的定位。取各组AR42J细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% TritonX-100室温放置20 min，山羊血清封闭1 h，滴加HMGB1一抗(1∶75)，4 ℃湿盒中孵育12 h，避光滴加羊抗兔IgG-FITC二抗(1∶250，北京Solarbio公司)，37℃孵育1 h，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，即用型，北京Solarbio公司)核染10 min后进行封片，荧光倒置显微镜下观察，摄片，应用Image-ProPlus 6.0进行分析。

六、统计学处理

结 果

一、不同浓度H2O2对AR42J细胞生存率的影响

0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2处理AR42J细胞24 h后的生存率分别为100%、(96.24±6.21)%、(95.38±3.15)%、(77.20±3.65)%、(16.26±2.74)%、(2.72±0.16)%(图1)。0.04、0.08 mmol/L H2O2对AR421细胞的生存率无显著影响，0.16、0.32、0.64 mmol/L H2O2均能显著抑制AR42J细胞的生存率，差异有统计学意义(t值分别为10.83、52.95、10.57，P值均<0.05)，因0.32、0.64 mmol/L H2O2处理后的细胞生存率太低，故后续实验选取0.16 mmol/L作为H2O2处理AR42J细胞的适宜浓度。

二、H2O2及OM对AR42J细胞HMGB1蛋白表达的影响

对照组、H2O2组、H2O2+OM组细胞培养24 h后，AR42J细胞HMGB1蛋白相对表达量分别为0.69±0.02、1.04±0.04、0.82±0.02(图2)，H2O2组显著高于对照组，H2O2+OM组显著低于H2O2组，但仍高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为8.59、4.92、4.50，P值均<0.05)。

三、H2O2及OM对AR42J细胞HMGB1蛋白分泌量的影响

对照组、H2O2组、H2O2+OM组细胞培养上清液中HMGB1蛋白水平分别为(2.68±0.07)、(4.84±0.13)、(3.97±0.10)μg/L，H2O2组显著高于对照组，H2O2+OM组显著低于H2O2组，但仍高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为20.37、7.57、14.92，P值均<0.05)。

注：H2O2为过氧化氢

图1不同浓度H2O2对AR42J细胞生存率的影响

注：H2O2为过氧化氢；OM为氧化苦参碱；HMGB1为高迁移率族蛋白B1

图2对照组(1)、H2O2组(2)和H2O2+OM组(3)AR42J细胞HMGB1蛋白表达

四、H2O2及OM对AR42J细胞HMGB1蛋白胞内定位的影响

对照组、H2O2组、H2O2+OM组AR42J细胞胞质内HMGB1蛋白占细胞HMGB1蛋白总量的比例分别为(10.7±1.9)%、(35.7±2.5)%、(27.3±1.7)%(图3)，H2O2组AR42J细胞胞质中HMGB1蛋白占比显著高于对照组，而H2O2+OM组AR42J细胞胞质中HMGB1蛋白占比显著低于H2O2组，但仍高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为11.31、3.90、9.29，P值均<0.05)。提示AR42J细胞HMGB1蛋白定位于胞核，H2O2处理后AR42J细胞内HMGB1蛋白由胞核向胞质移位，预先用OM干预能抑制HMGB1蛋白从胞核向胞质转移。

讨 论

胰腺炎早期以无菌性损伤为特征，胰腺腺泡细胞损伤甚至坏死，细胞内容物从受损或死亡的细胞中释放到细胞外，其作为损伤相关分子谱(damage associated molecular patterns, DAMPs)，在AP的致病过程中起着核心作用[13-15]。DAMPs主要包括HMGB1、热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)、DNA、ATP等，它们具有类细胞因子、趋化因子或生长因子的活性，通过血液循环运输到全身各处，从而将局部组织损伤与全身炎症反应综合征(SIRS)联系起来，导致随后发生的多器官功能衰竭(MOF)，甚至死亡[14,16]。HMGB1作为一种最典型和广泛研究的DAMPs，在AP的发展过程中起着非常重要的作用，它既可由应激细胞主动分泌，也可由死亡细胞被动释放，作为一种警报信号反映细胞的应激状态[17-18]。细胞实验表明，HMGB1能够通过TLR4或RAGE受体激活巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和T细胞等，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子，进而扩大和加重炎症反应[17-20]。动物实验表明，急性坏死性胰腺炎小鼠血清HMGB1水平明显高于正常小鼠[21]。临床研究表明，AP患者的血清HMGB1水平升高，且与疾病的严重程度呈正相关[22-23]；而抑制HMGB1的表达和释放以及阻断TLR4或RAGE受体均能有效缓解胰腺炎症[18,20,24-27]。

ROS是细胞代谢过程中关键信号分子，调控包括蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)、酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、MAPKs和NF-κB等多种信号分子，在细胞生存和死亡过程中发挥着关键作用[28]。H2O2作为活性氧中的一种，低浓度时能够引起细胞抗氧化防御系统激活，而高浓度则引起细胞氧化应激损伤甚至坏死[5]。本实验根据MTT结果，采用0.16 mmol/L H2O2诱导AR42J细胞氧化应激，结果显示H2O2组细胞内HMGB1蛋白表达和分泌到细胞上清液中的HMGB1均显著增多，表明H2O2能够诱导AR42J 细胞HMGB1表达和释放。H2O2处理AR42J细胞后发生了HMGB1由胞核向胞质再向胞外转移，提示HMGB1可能在胰腺炎的发病机制中起重要作用。应用OM干预后，HMGB1的表达和释放均较H2O2组显著下降，HMGB1蛋白由胞核向胞质的移位显著减弱，提示OM可能通过稳定核膜与胞膜进而减轻氧化应激所造成的细胞损伤。

注：H2O2为过氧化氢；OM为氧化苦参碱；HMGB1为高迁移率族蛋白B1；DAPI为4′，6-二脒基-2-苯基吲哚

图3H2O2及OM对AR42J细胞内HMGB1蛋白移位的影响 3A～3C：对照组；3D～3F：H2O2组；3G～3I：H2O2+OM组；3A、3D、3G为蛋白定位(免疫荧光，×400)；3B、3E、3H为DAPI染色；3C、3F、3I为叠加

综上分析，鉴于细胞损伤和死亡所释放的DAMPs在AP致病过程中的重要驱动作用，提示HMGB1可能是治疗胰腺炎的重要靶点，而OM可能是改善胰腺炎症的有效药物。HMGB1结构和功能复杂，探讨HMGB1的作用机制能够更好地理解局部组织损伤与SIRS之间的关系，以便选择更有针对性的治疗方案，为胰腺炎的治疗提供新的策略。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突