SIRT1信号通路介导葛根素抵抗脓毒症心肌损伤的机制研究

郑 超,田作春,苏永超,马继鹏

(1海南省第三人民医院心胸外科,三亚 572000;2空军军医大学西京医院心血管外科;*通讯作者,E-mail:zhengchaosanya@126.com)

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征,是一项全球性公共卫生问题[1]。据报道,脓毒症的年发病率约为535/10万,且仍在不断升高,其院内死亡率高达25%-30%[2]。尽管临床监护技术和手段已经取得了巨大进展,但脓毒症依旧是重症监护室的主要致死原因之一[3]。心脏是脓毒症患者最易发生损伤的器官,约50%的脓毒症患者会出现心功能不全[4,5]。葛根素(puerarin,Pue)是从葛根中提取的有效活性成分之一[6]。以往研究表明,葛根素能够明显减轻脓毒症引起的心肌损伤[7,8],但其机制仍未完全阐明。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一种进化上高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶,参与调节细胞衰老、炎症、凋亡和自噬等多种病理生理过程[9-12]。SIRT1在脓毒症小鼠心肌组织的表达量明显减少,而激活SIRT1可明显改善盲肠结扎穿孔引起的心功能障碍[13]。因此,SIRT1被认为是治疗脓毒症心肌损伤的潜在干预靶标。以往研究发现,SIRT1是葛根素抵抗糖尿病肾病[6]、膀胱癌[14]、脑缺血再灌注损伤[15]等疾病的关键下游分子。但SIRT1是否介导葛根素抗脓毒症心肌损伤作用尚未见报道。本研究拟采用动物实验探究葛根素能否通过激活SIRT1信号通路缓解脓毒症引起的心肌损伤。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

C57小鼠(体质量22-25 g)由空军军医大学实验动物中心提供,饲养于清洁级环境中。葛根素(货号:82435)和EX527(SIRT1抑制剂,货号:E7034)购自Sigma-Aldrich公司(美国)。二氢乙锭(货号:D23107)染液购自Thermo Fisher Scientific公司(美国)。抗Ac-p53(货号:2570)、SIRT1(货号:8469)和β-actin(货号:4970)抗体购自CST公司(美国)。羊抗兔和羊抗鼠抗体购自北京中杉金桥公司(中国)。TNF-α(货号:H052)和IL-1β(货号:H002)ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所(中国)。

1.2 脓毒症小鼠模型的构建

盲肠结扎穿孔术前所有小鼠禁食8 h。参照以往文献[16]所述的方法施行盲肠结扎穿孔术。简要步骤如下:用水合氯醛麻醉小鼠后将其固定于无菌手术台上;经腹部正中切开1 cm的切口,并逐层暴露盲肠;将粪便轻轻挤压至盲肠远端,用细线结扎盲肠,并用18号针头刺穿盲肠;通过穿刺部位挤出部分肠内容物;将盲肠推回腹腔,关闭腹腔并缝合各层;术后将小鼠放回笼中,自由进食进水。假手术组小鼠除不进行盲肠结扎穿孔外,其余手术操作均相同。

1.3 动物分组

按照随机数字表法将实验小鼠随机分组(n=6)如下:①假手术组(sham组):术前通过腹腔注射给予生理盐水(0.2 ml/d),共给药3次,而后进行假手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的生理盐水(0.2 ml);②葛根素处理组(Pue组):术前通过腹腔注射给予生理盐水(0.2 ml/d),共给药3次,而后进行假手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的葛根素(10 mg/kg);③脓毒症组(sepsis组):术前通过腹腔注射给予生理盐水(0.2 ml/d),共给药3次,而后进行盲肠结扎穿孔手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的生理盐水(0.2 ml);④脓毒症+葛根素组(sepsis+Pue组):术前通过腹腔注射给予生理盐水(0.2 ml/d),共给药3次,而后进行盲肠结扎穿孔手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的葛根素(10 mg/kg);⑤EX527(SIRT1抑制剂)+脓毒症+葛根素(EX527+sepsis+Pue)组:术前通过腹腔注射给予5 mg/(kg·d)EX527,共给药3次,而后进行盲肠结扎穿孔手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的葛根素(10 mg/kg);⑥EX527+脓毒症(EX527+sepsis)组:术前通过腹腔注射给予5 mg/(kg·d)EX527,共给药3次,而后进行盲肠结扎穿孔手术操作,术后通过腹腔注射给予单剂量的生理盐水(0.2 ml)。

1.4 心脏收缩功能检测

参照文献[17]所述方法,用VEVO 2100(Visual Sonics公司,加拿大)小动物超声影像系统检测各组小鼠左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)。

1.5 心肌组织TUNEL染色

按照TUNEL试剂盒(Roche公司)说明书所述步骤对心肌组织石蜡切片(切片厚度5 μm)进行TUNEL染色(检测凋亡细胞的细胞核)和DAPI染色(检测所有细胞核)。心肌凋亡率表示为TUNEL阳性细胞核数/总细胞核数×100%。

1.6 Western blotting检测SIRT1和Ac-p53的表达量

在冰上用RIPA裂解液裂解心肌组织提取蛋白质,而后用BCA试剂盒检测组织蛋白的浓度;使用10%SDS-PAGE分离蛋白质样品(40 μg)后湿转至PVDF膜;用5%脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜2 h;将PVDF膜与抗Ac-p53(1 ∶1 000稀释)、SIRT1(1 ∶1 000稀释)和β-actin(1 ∶1 000稀释)抗体在4 ℃下孵育12-18 h;将膜用TBST缓冲液洗涤3次(每次5 min),并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀释)以及羊抗鼠二抗(1 ∶5 000稀释)在室温下孵育2 h;将膜用TBST缓冲液洗涤3次(每次5 min);用ECL化学发光液、BioRad成像系统和Image Lab软件测定各组小鼠心肌组织目的蛋白表达情况。

1.7 心肌活性氧产量测定

盲肠结扎穿孔后48 h迅速取心脏并冻于液氮内,用冰冻切片机将心脏切成厚度为10 μm的组织切片。严格按照试剂盒说明书对组织切片进行二氢乙锭染色,拍照后用Image J软件分析各组小鼠心肌组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)产量。

1.8 血清内TNF-α和IL-1β水平测定

严格按照试剂盒说明书,使用ELISA试剂盒测定各组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌组织SIRT1和Ac-p53表达的影响

与sham组相比,Pue组小鼠心肌组织SIRT1的表达量轻度增高,而SIRT1靶蛋白p53的乙酰化水平轻度降低,但变化无统计学意义(P>0.05)。与sham组相比,sepsis组小鼠心肌组织SIRT1的表达量明显降低,而SIRT1靶蛋白p53的乙酰化水平明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,sepsis+Pue组小鼠心肌组织SIRT1的表达量明显增高,而p53的乙酰化水平明显降低(P<0.05)。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠SIRT1的表达量明显降低,而p53的乙酰化水平明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,EX527+sepsis组小鼠心肌组织SIRT1的表达量轻度降低,但差异无统计学意义(P>0.05);SIRT1靶蛋白p53的乙酰化水平明显增高(P<0.05,见图1)。

1.sham组；2.Pue组；3.sepsis组；4.sapsis+Pue组；5.EX527+sepsis+Pue组；6.EX527+sepsis组与sham组相比,*P<0.05;与sepsis组相比,#P<0.05;与sepsis+Pue组相比,△P<0.05图1 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌组织SIRT1和Ac-p53表达的影响 (n=6)Figure 1 Effects of puerarin and EX527 on the expression of SIRT1 and Ac-p53 in myocardial tissue of septic mice (n=6)

2.2 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心脏收缩功能的影响

心脏超声结果显示,与sham组相比,Pue组小鼠LVEF和LVFS无明显变化(P>0.05)。与sham组相比,sepsis组小鼠LVEF和LVFS明显降低(P<0.05)。与sepsis组相比,sepsis+Pue组小鼠LVEF和LVFS明显增高(P<0.05)。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠LVEF和LVFS明显降低(P<0.05)。与sepsis组相比,EX527+sepsis组小鼠LVEF和LVFS无明显变化(P>0.05,见图2)。

与sham组相比,*P<0.05;与sepsis组相比,#P<0.05;与sepsis+Pue组相比,△P<0.05图2 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心脏收缩功能的影响 (n=6)Figure 2 Effects of puerarin and EX527 on cardiac systolic function of septic mice (n=6)

2.3 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌组织ROS产量的影响

二氢乙锭染色结果显示,与sham组相比,Pue组小鼠心肌组织ROS产量无明显变化(P>0.05)。与sham组相比,sepsis组小鼠心肌组织ROS产量明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,sepsis+Pue组小鼠心肌组织ROS产量明显降低(P<0.05)。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠心肌组织ROS产量明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,EX527+sepsis组小鼠心肌组织ROS产量轻微增加,但差异无统计学意义(P>0.05,见图3)。

图3 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌组织ROS产量的影响 (n=6)Figure 3 Effects of puerarin and EX527 on the myocardial ROS production of septic mice (n=6)

2.4 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌凋亡率的影响

TUNEL染色结果显示,与sham组相比,Pue组小鼠心肌凋亡率无明显变化(P>0.05)。与sham组相比,sepsis组小鼠心肌凋亡率明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,sepsis+Pue组小鼠心肌凋亡率明显降低(P<0.05)。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠心肌凋亡率明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,EX527+sepsis组小鼠心肌凋亡率轻微增加,但差异无统计学意义(P>0.05,见图4,5)。

图4 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌凋亡率的影响 (TUNEL染色,×400)Figure 4 Effects of puerarin and EX527 on the apoptotic ratio of cardiomyocytes in septic mice by TUNEL (×400)

与sham组相比,*P<0.05;与sepsis组相比,#P<0.05;与sepsis+Pue组相比,△P<0.05图5 葛根素和EX527对脓毒症小鼠心肌凋亡率的影响 (n=6)Figure 5 Effects of puerarin and EX527 on the apoptotic ratio of cardiomyocytes in septic mice (n=6)

2.5 葛根素和EX527对脓毒症小鼠炎症反应的影响

ELISA试剂盒检测结果显示,与sham组相比,pue组小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量无明显变化(P>0.05)。与sham组相比,sepsis组小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,sepsis+Pue组小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量明显降低(P<0.05)。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量明显增高(P<0.05)。与sepsis组相比,EX527+sepsis组小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量无明显变化(P>0.05,见图6)。

3 讨论

近年来多项研究[18-20]显示,葛根素具有显著的心血管保护作用。Shi等[18]发现,葛根素是一种有效的降血压药物,而且eNOS是葛根素发挥降血压作用的关键作用靶点。Zhao等[19]证实,葛根素能通过上调Nrf2的表达并促进Nrf2的核转位,抑制腹主动脉缩窄引起的心肌肥厚。Chen等[20]发现,葛根素主要通过提高过氧化氢酶活性和下调Rac-1表达抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞增殖,从而发挥抗心肌纤维化作用。值得注意的是,葛根素也能够明显减轻脓毒症引起的心肌损伤[7,8]。在该研究中,我们发现,与sham组相比,Pue组小鼠LVEF和LVFS无明显变化,提示葛根素对于正常小鼠的心脏功能无明显影响。与sham组相比,sepsis组小鼠LVEF和LVFS明显降低,而葛根素可以明显提高脓毒症小鼠LVEF和LVFS。以上结果提示,葛根素可明显抑制脓毒症引起的心肌损伤,改善小鼠心脏收缩功能,该结论与以往研究[7,8]结果相一致。

氧化应激损伤、炎症反应和细胞凋亡在脓毒症引起的心脏功能不全中发挥了重要作用,而抑制氧化应激损伤、炎症反应和细胞凋亡能有效缓解脓毒症心肌损伤[21,22]。以往研究表明,葛根素具有抗氧化应激、抗炎和抗凋亡生物作用。Zhang等[23]证实,葛根素具有降血糖作用,并且可通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制氧化应激,从而预防糖尿病大鼠白内障的发生和发展。Xu等[24]证实,葛根素可通过调节miR-21,抑制细胞凋亡和氧化应激,从而发挥抗心肌缺血再灌注损伤作用。Liu等[25]证实,葛根素可减轻炎症反应,减少心脏中性粒细胞浸润和氧化应激,进而预防严重烧伤引起的急性心肌损伤。在该研究中,我们发现,与sham组相比,Pue组小鼠心肌组织ROS产量、血清内TNF-α和IL-1β含量以及心肌凋亡率无明显变化,提示葛根素对于正常小鼠心肌组织氧化应激状态、炎症反应程度和凋亡情况无明显影响。与sham组相比,sepsis组小鼠心肌组织ROS产量、血清内TNF-α和IL-1β含量以及心肌凋亡率明显增高。而葛根素能够明显降低脓毒症小鼠心肌组织ROS产量、血清内TNF-α和IL-1β含量,减少心肌凋亡。以上结果提示,葛根素主要通过抑制氧化应激损伤、炎症反应和凋亡抵抗脓毒症引起的心脏功能不全。

与sham组相比,*P<0.05;与sepsis组相比,#P<0.05;与sepsis+Pue组相比,△P<0.05图6 葛根素和EX527对脓毒症小鼠血清内TNF-α和IL-1β含量的影响 (n=6)Figure 6 Effects of puerarin and EX527 on serum TNF-α and IL-1β levels in septic mice (n=6)

SIRT1是机体内最主要的去乙酰化酶之一,是心血管疾病防治领域的明星分子。上调SIRT1的表达或活性能明显减轻心肌缺血再灌注损伤[26]、糖尿病心肌病[27]、动脉粥样硬化和心肌肥厚[28]等心血管疾病。特别值得注意的是,SIRT1也是缓解脓毒症心肌损伤的关键干预靶点。Zhang等[29]发现,褪黑素可通过激活小鼠SIRT1调节细胞凋亡和自噬,改善脓毒症引起的心功能不全。Chen等[30]证实,曲美他嗪可通过激活SIRT1信号通路改善LPS诱导的心肌功能障碍和细胞凋亡,抑制巨噬细胞的促炎反应。此外,SIRT1可通过去乙酰化修饰p53,在调节心肌氧化应激状态、炎症反应和凋亡方面扮演重要角色[28,31,32]。在该研究中,我们发现,与sham组相比,脓毒症组小鼠心肌组织SIRT1表达量明显降低,伴随其下游靶点p53的乙酰化水平明显增加,提示SIRT1的活性也明显受损。而葛根素可明显增加脓毒症小鼠心肌组织内SIRT1的表达量和活性。为了探究SIRT1信号通路是否介导葛根素抵抗脓毒症心肌损伤作用,我们利用EX527特异性地抑制SIRT1信号。与sepsis+Pue组相比,EX527+sepsis+Pue组小鼠心肌组织ROS产量、血清内TNF-α和IL-1β含量以及心肌凋亡率明显增高,而LVEF和LVFS明显降低。以上结果提示,阻断SIRT1信号通路可明显减弱葛根素抗心肌组织氧化应激损伤、炎症反应、凋亡、改善心脏收缩功能的心肌保护作用。

综上,该研究通过小鼠实验证实,葛根素可通过抑制氧化应激损伤和炎症反应,降低心肌凋亡率,改善心脏功能,进而缓解脓毒症心肌损伤,且其保护作用主要由SIRT1信号介导。该研究为进一步探究葛根素缓解脓毒症心肌损伤的分子机制及其临床应用奠定了的理论基础。