豨莶草调控sirt1/FOXO1通路对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的影响

2020-02-29唐晓栋兰晓飞葛黁黁唐仲海樊成虎

中国免疫学杂志 2020年4期

唐晓栋赵庆兰晓飞葛黁黁唐仲海樊成虎

(甘肃省中医院脊柱一科,兰州 730050)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是临床上的常见病，多发于60岁以上的老年人，其中男性、女性发病率分别为9.6%、18%[1]。KOA以软骨细胞丢失，软骨形态改变、破坏，伴关节周围骨质增生性反应等病理改变为主，造成关节软骨退行性改变、损伤，导致患者关节功能障碍、疼痛等临床症状，严重影响患者的身心健康及生活质量[2,3]，因此修复软骨形态及功能，抑制软骨损伤是治疗KOA的关键。研究发现，豨莶草是一种岭南特色中药，具有清热解毒、祛风湿、利关节的功效，可缓解关节疼痛，用于治疗风湿痹症、腰膝酸软、筋骨无力等症状[4]，能减轻急性痛风性关节炎大鼠关节炎症，改善其临床症状[5]，因此豨莶草可能对膝骨关节炎大鼠软骨损伤具有治疗作用。sirt1/FOXO1介导炎症及氧化应激反应，以白藜芦醇激活该信号，可减轻肾病患者的氧化应激损伤及炎性细胞浸润程度[6]；另外，sirt1蛋白、FOXO转录因子在软骨细胞生长、成熟和基质合成等生理过程中起重要的调节作用，激活sirt1可抑制软骨细胞凋亡，减轻其氧化应激损伤，抑制关节炎病情发展[7,8]，因此调控sirt1/FOXO1信号可能是豨莶草减轻膝骨关节炎大鼠软骨损伤的作用机制，本研究通过建立KOA大鼠模型，探讨豨莶草调控sirt1/FOXO1通路对膝骨关节炎大鼠软骨损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性SD大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SYXK(沪) 2014-0005，质量合格证号：2015000504404，SPF级，体重：180～220 g。在本院动物房中饲养：昼夜交替、自然光照，恒温25℃，相对湿度为50%，大鼠自由饮水、摄食，期间定时添加饲料及饮用水、更换垫料、对鼠笼进行清理及消毒，保持饲养环境清洁、安静，通风良好，每小时换气8～12次。

1.1.2主要试剂与仪器豨莶草(JD-21822)购自上海晶都生物技术有限公司；脱钙液(RKD0025)购自长沙达尔锋生物科技有限公司；软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)ELISA试剂盒(ER0462)购自武汉菲恩生物科技有限公司；尼克酰胺(ab120864)、TNF-α ELISA试剂盒(ab100785)、IL-1β ELISA试剂盒(ab100768)、兔源GAPDH一抗(ab181602)，兔源sirt1一抗(ab189494)，兔源FOXO1一抗(ab39670)，羊抗兔二抗(ab150077)购自美国Abcam公司；acely-FOXO1一抗(YP49437)购自上海亚培生物科技有限公司；HE染色试剂盒(C0105)、RIPA裂解液(P0013K)、BCA试剂盒(P0011)购自上海碧云天公司。YLS-3E电子压痛仪购自安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司；37370足底热辐射测痛仪购自意大利Ugo Basile公司；Eclipse E200实验室教学生物显微镜购自日本尼康公司；Elx800酶标仪、1659001蛋白电泳仪、Trans-Blot SD半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司；RM2035轮转切片机、EG1160包埋机、HI1220烤片机购自德国Leica公司；游标卡尺、关节测量医用测角尺购自北京若水合科技有限公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立及分组给药参照文献[9]方法：采用棉垫对大鼠左后肢股骨上端到小腿关节上1 cm处进行包裹，并以石膏予以固定，待石膏硬化后，将大鼠放回鼠笼继续饲养，6周后，拆除石膏。共造模48只，分为模型组、豨莶草组、NA组、豨莶草+NA组4组，每组12只；另取12只大鼠不做处理，设为对照组。

参照文献进行剂量换算后，分别以生理盐水配制终浓度为0.2 g/ml豨莶草溶液[10]、10 mg/ml NA溶液[11]，豨莶草+NA混合溶液(豨莶草为0.2 g/ml，NA为10 mg/ml)，用药组每天以10 ml/kg的剂量灌胃，模型组和对照组以等剂量的生理盐水灌胃，每天1次，持续21 d。

1.2.2各组大鼠膝关节宽度、被动活动度测量给药结束24 h后，游标卡尺测量记录各组大鼠患侧膝关节宽度，每只大鼠测量3次，取平均值；医用测角尺测量各组大鼠患侧膝关节被动活动度，具体操作如下：大鼠患侧股骨与量角器的固定尺一端保持平行，关节活动的轴心与量角器的轴心位置相对，被动伸直和屈曲大鼠膝关节，并随胫骨屈伸移动角尺，当大鼠膝关节伸直到最大时，记录此时角尺角度，为最大伸直角度；当大鼠膝关节屈曲到最大时，记录此时角尺角度，为最大屈曲角度。关节被动活动度=最大屈曲角度-最大伸直角度，每只大鼠测量3次，取其平均值。

1.2.3各组大鼠压痛阈值、热痛阈值检测采用YLS-3E电子压痛仪测定各组大鼠压痛阈值：将大鼠以圆桶固定，使其安静、处于较舒适状态，压痛仪的扁型头向大鼠患侧后足背施压，当大鼠鸣叫或挣扎时记录显示的压力值即为压痛阈值；每只大鼠测量3次，每次间隔10 min，取其平均值。采用足底热辐射测试仪测定各组大鼠热痛阈值：室温下将大鼠置于透明有机玻璃箱内，待其安静后，将测试仪上的“十”字形标记置于大鼠患侧足底中央，并避开足垫，打开仪器并计时，当大鼠鸣叫或抬腿回避时，所用的时间即为大鼠热痛阈值；每只大鼠测量3次，每次间隔10 min，取其平均值，为防止大鼠被烫伤，测定的时间上限为20 s，温度上限为35℃。

1.2.4标本采集及HE染色1.2.1中各组大鼠麻醉后，尾静脉取血2 ml，静置15 min，3 000 r/min，4℃，离心15 min，收集上清即为血清，储存于-80℃冰箱中备用；打开大鼠患侧关节腔，以锋利刀片取出关节软骨部位，剪取约0.5 g储存于-80℃冰箱中备用，其他组织置于10%甲醛溶液中固定24 h后，以脱钙液脱钙、梯度酒精(由低到高)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，使用切片机做病理切片，对其进行脱蜡、高浓度到低浓度酒精依此浸泡，以HE染色试剂盒进行染色，具体按照说明书进行操作，以同样方法再次脱水、透明后，进行封片，在光学显微镜下观察膝关节软骨病理变化，任选5个视野进行拍照，并根据软骨组织的病理改变情况，进行Mankin′s评分，评分标准如表1，Mankin′s评分为各组之和。

1.2.5各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平测定1.2.4中各组大鼠血清置于4℃解冻，采用ELISA试剂盒测定血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平，具体操作参照说明书步骤进行。

1.2.6各组大鼠膝关节软骨组织中sirt1、FOXO1、acely-FOXO1蛋白水平的检测1.2.4中冻存软骨组织在研钵中研碎，加入蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制剂)于冰浴中采用匀浆机匀浆，得匀浆液，3 000 r/min 4℃离心20 min，取上清液，参照BCA试剂盒说明，以其测定上清液中总蛋白浓度，根据结果调整各组蛋白浓度使之相同，煮沸变性后取20 μl蛋白使用电泳仪SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，加入5%脱脂奶粉，室温封闭2 h，分别以兔源GAPDH、sirt1、FOXO1、acely-FOXO1一抗4℃孵育过夜，经TBST溶液漂洗3次后，以羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBST再漂洗3次，采用增强化学发光法显色，在凝胶成像仪中观察并拍摄图像，以Image J分析各组蛋白的相对表达量。

表1 Mankin′s评分标准[12]Tab.1 Mankin′s score standard[12]

2 结果

2.1各组大鼠膝关节宽度、被动活动度比较与对照组相比，模型组大鼠膝关节宽度升高(P<0.05)，被动活动度降低(P<0.05)。与模型组相比，豨莶草组大鼠膝关节宽度降低(P<0.05)，被动活动度升高(P<0.05)；NA组大鼠膝关节宽度升高(P<0.05)，被动活动度降低(P<0.05)。与豨莶草组相比，豨莶草+NA组大鼠膝关节宽度升高(P<0.05)，被动活动度降低(P<0.05)。与NA组相比，豨莶草+NA组大鼠膝关节宽度降低(P<0.05)，被动活动度升高(P<0.05)，见表2。