TNFAIP8在小鼠肠道组织及肠道炎症中的表达及意义①

韩美娟 牛 凯 娄运伟 王 辉

(河南省免疫与靶向药物重点实验室，新乡医学院医学检验学院，新乡 453003)

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和Crohn′s氏病(Crohn′s disease)，是一组肠道炎症性疾病，其病因尚不清楚，目前认为炎症性肠病的发生主要与遗传、免疫、肠道菌群和环境等因素有关[1,2]。尽管大部分研究已经表明，正常生理状态下机体内有较多信号通路参与并维持正常肠道上皮细胞处于稳定的状态，然而对于肠道组织在外界应激及损伤状态下恢复其稳定状态的机制研究还较为匮乏[3]。

肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8(tumor necrosis factor-α induced protein-8,TNFAIP8或TIPE)家族是近些年新发现的一个蛋白家族，主要由4组成员构成：TNFAIP8(TIPE)、TIPE1(TNFAIP8-like 1，TNFAIP8L1)、IPE2(TNFAIP8-like 2，TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3-like 3， TNFAIP8L3)，家族成员之间具有其独特的蛋白结构及高度同源的蛋白序列。但TIPE家族成员间也存在着细微的蛋白结构差异，并且在机体组织中的表达也存在差异，提示其家族成员在不同组织中有不同的生物学功能[4]。

TIPE也被称为SCCS2、GG21或MDC3.13，是TNFAIP8家族最早被发现的成员。TIPE被首次发现是在人头颈部鳞状细胞癌 (head and neck squam-ous cell carcinoma,HNSCC)患者及来自该患者的转移性细胞系[1]。TIPE在人的淋巴组织中表达相对较高，在肺、胸腺、脾脏组织表达相对较低[1]。TIPE在肿瘤领域研究的较为广泛，但目前对TIPE的生理作用包括在肠道组织中的作用知之甚少。本研究旨在探究TIPE在小鼠肠道组织中的表达特点和表达调节变化。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8～10周龄的WT雄性小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠均饲养于无特定病原体级环境中。

1.1.2主要的试剂与仪器 葡聚糖硫酸酯钠盐(dextran sodium sulfate，DSS)(相对分子量为36 000～50 000)购自美国MP Biomedicals公司；逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；β-actin抗体和TIPE抗体(货号为66009-1和15790-1)、HRP标记的山羊抗小鼠二抗和山羊抗兔二抗购自Proteintech公司(货号分别为SA00001-1和SA000 01-2)；实时荧光定量聚合酶链反应(polymer-ase chain reaction,PCR)仪购自上海赛默飞世尔科技有限公司；Citrobacter rodentium菌为本实验室保存菌种。

1.2方法

1.2.1取材 颈椎脱臼处死小鼠，取全十二指肠、空肠、回肠、结肠测量其长度。用剪刀将其剖开，PBS漂洗。取3 cm进行研磨后放于-80℃保存， Western blot检测蛋白表达。再取1.0 cm加入1 ml TRIzol，放于-80℃保存,实时定量PCR检测mRNA表达。

1.2.2分离结肠上皮细胞 用冷PBS冲洗结肠并切成小块，将切成小段的结肠在含 EDTA-DTT的HBSS缓冲液中37℃缓慢摇动20 min，用70 μm的滤器过滤后，取上清液，通过离心获取单细胞。经上皮细胞特异性的抗体EpCam染色后确定，约85%以上的细胞都是EpCam 阳性的结肠上皮细胞。根据需要，分离的结肠上皮细胞，-80℃保存,行Western blot和实时定量PCR检测。

1.2.3Real-time PCR 细胞中总RNA的抽提使用Invitrogen的TRIzol试剂，并严格按照操作手册操作。基因转录本的扩增使用Applied Biosystems的7500 Fast Real-time PCR System，PCR程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；72℃ 5 min。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。所用引物序列如表1所示。

1.2.4Western blot 将细胞收集后，提取各组细胞总蛋白，用BCA Kit测定蛋白浓度，用SDS-PAGE胶进行电泳，电泳后进行转膜，将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，孵育一抗，4℃过夜。用TBST洗膜液洗膜3次后，孵育二抗，室温孵育1 h，最后用TBST洗涤3次后用发光液进行曝光。

1.2.5DSS处理小鼠 配制DSS溶液：称取适量DSS于蒸馏水中，配制成3.0%浓度(w/v)的DSS溶液，配制好的溶液储存于4℃冰箱，要求现配现用。以3.0%DSS喂养小鼠诱导实验性结肠炎动物模型，每天观察小鼠的疾病变化，在不同的时间点处理小鼠，收集样本。

1.2.6Citrobacter rodentium灌胃 小鼠在Citrob-acter rodentium灌胃之前饥饿过夜，记录小鼠灌胃前的体重，用无菌灌胃针对小鼠实施灌胃，每只小鼠灌胃约200 μl，其菌量约为2×109的Citrobacter rodentium。灌胃之后小鼠保持正常饮食，每隔2 d记录一次小鼠体重变化，在不同的时间点处理小鼠，收集样本。

2 结果

2.1TIPE在结肠组织中高表达 首先检测TNFAIP8家族成员TNFAIP8(TIPE)、TIPE1、TIPE2和TIPE3在结肠组织中的相对表达，在整个家族成员中，TIPE和TIPE1的表达比TIPE2的表达高，而TIPE3的表达最低(图1A)，此外实时荧光定量PCR结果显示，与其他家族成员相比，TIPE在结肠中表达最高(图1B)。

图1 TNFAIP8家族基因在小鼠结肠组织中的表达Fig.1 Expression of TNFAIP8 family gene in mouse colon tissueNote:A.The total RNA of distal colon tissue of WT mice was extracted,and the mRNA expression level of TNFAIP8 family members was detected by RT-PCR.β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR for quantifying mRNA expression.These are 3 test results.The graphical data is the relative expression level of the

2.2TIPE在结肠上皮细胞中表达最高 从正常小鼠中分别提取出十二指肠、空肠、回肠和结肠组织中的上皮细胞，与十二指肠、空肠和回肠组织中的上皮细胞相比，Real-time PCR和Western blot结果显示，TIPE在结肠上皮细胞中表达最高(图2A、B)。

图2 TIPE在小鼠肠道组织上皮细胞中的表达Fig.2 Expression of TIPE in mouse intestinal epithel-ial cellsNote:A.Total RNA was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of TIPE mRNA in these epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the protein was extracted from epithelial cells of duodenum,empty,ileum and colon of WT mice.Western blot was used to detect the expression levels of TIPE in tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene(n=5).These are 3 test results.

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in Real-time PCR

2.3TIPE在DSS诱导的结肠炎症中表达上调 以3.0%DSS喂养WT小鼠诱导实验性结肠炎，在不同的时间点提取小鼠结肠上皮细胞，RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示，随着DSS诱导时间的延长，TIPE在结肠上皮细胞的表达上调(图3A、B)。

2.4TIPE在Citrobacter rodentium诱导的结肠炎症中表达上调 用Citrobacter rodentium对WT小鼠灌胃诱导实验性结肠炎，在不同的时间点提取小鼠结肠上皮细胞，RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示，随着诱导时间的延长，TIPE在结肠上皮细胞的表达上调(图4A、B)。

图4 TIPE在Citrobacter rodentium感染诱导肠炎过程中在小鼠结肠上皮细胞的表达上调Fig.4 Up-regulation of TIPE expression in mouse colonic epithelial cells during Citrobacter rodentium infection-induced enteritisNote:A.Infecting WT mice with Citrobacter rodentium to induce experimental colitis.The mice were sacrificed at different time points,and total RNA from epithelial cells of mice colon tissue was extracted.Detecting the expression level of TIPE by RT-PCR,β-actin was used as an internal reference gene；B.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of TIPE mRNA in these tissue epithelial cells.β-actin was used as an internal reference gene.These are 3 test results.The data shown the relative expression levels of the

3 讨论

大部分研究发现TIPE在正常生理过程及病理过程中发挥着很重要的作用，如调节糖皮质激素对T细胞凋亡的影响[5]，通过促进巨噬细胞IL-1β和GM-CSF细胞因子的产生来抵抗细菌的感染[6]，通过激活哺乳动物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin,mTOR)激酶保护多巴胺神经元氧化应激诱导的细胞死亡[7]，调节高糖诱导的肾小球系膜细胞的增殖[8]。但对TIPE在肠道中的生理作用及其具体机制的研究甚少。

近年来随着我国生活水平、饮食习惯的改变，以及结肠镜的普遍应用和对疾病的深入认识，我国IBD的就诊人数与日俱增，其发病率在近20年间增长近10倍[9]。在临床上，IBD的发病与多种因素有关。IBD患者的临床表现为腹泻、黏液血便及腹痛等，病程呈慢性疼痛期与缓解期交替出现，可伴有较多的其他肠道性并发症,严重影响了患者的生活质量[10]。肠道上皮细胞完整性的维持在保护机体抵抗外界干扰，如药物、抗原和微生物等的过程中发挥至关重要的作用，上皮细胞死亡增加和增殖能力降低与DSS诱导的结肠炎的发生密切相关[11-13]。IBD的发生主要集中在结肠部位，而本研究证明了TIPE无论在结肠组织还是结肠上皮细胞中均表达较高。并且在构建的两种试验性结肠炎模型中TIPE在结肠上皮细胞的表达量随着DSS处理或Citrobacter rodentium感染时间的延长也随之增加。这些研究结果提示TIPE可能在DSS 或Citrobacter rodentium感染诱导的小鼠结肠炎中起着重要的调控作用，我们推测在结肠炎过程中，TIPE表达水平上调可能发挥重要的保护性作用，增强结肠上皮细胞抵抗细胞死亡的能力，从而促进受损的肠道有效快速修复，其具体的作用机制有待更深入的研究。