骨髓来源细胞在眼部新生血管形成中的研究进展

吕 洋,蒋 华,曹 虹，曹 娟,李 静,刘占宏，李 红

眼部新生血管常导致严重视力丧失[1-2]。近年来，有研究表明除原位细胞，骨髓来源细胞(bone marrow derived cells， BMCs)对眼部新生血管的形成有重要作用[3]。BMCs参与眼部新生血管的机制非常复杂，通过多种因素刺激、多种细胞和因子参与以及多条信号通路调控。本文总结已知BMCs在眼部新生血管，尤其是在角膜新生血管、视网膜新生血管和脉络新生血管中的作用和主要机制，以及影响BMCs作用的风险因素，综述如下。

1BMCs和眼部新生血管

众所周知，新生血管形成包括2个主要方式：血管发生和血管生成[4]。大量实验室研究表明，BMCs可分化为多种干细胞和单核巨噬细胞，在角膜、视网膜和脉络膜中发挥重要作用[5]。内皮祖细胞(endothelial precursor cells， EPCs)、造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)[4]可分化成血管成分[血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)、周细胞和内皮细胞(endothelial cells， ECs)]以及血管外细胞[肌成纤维细胞、炎性细胞、视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial， RPE)细胞和神经胶质细胞][3]。除干细胞之外，骨髓(bone marrow， BM)来源的单核巨噬细胞可分泌多种血管生成因子刺激基质细胞衍生因子1(stromal derived factor 1， SDF-1)在RPE细胞的表达，参与BMCs迁移及黏附到局部缺血或损伤的组织[5]。提示BMCs不仅可特异性地在眼部新生血管处聚集、增殖和分化为多种细胞等构成血管壁的成分，而且还可分泌多种促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)、转化生长因子(transforming growth factor， TGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)等参与新生血管的生成[1,5]。

1.1BMCs和角膜新生血管(corneal neovascularization， CV) 角膜是无血管组织，一些炎症性疾病、传染性疾病和外伤被认为与CV有关，CV可通过不同的方法人工诱导，如辅助手术致术源性角膜损伤新生血管形成和碱烧伤诱导实验性CV等[6]。有研究显示炎症性CV的老鼠模型中，CD11b阳性的BMCs参与基底膜与细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的裂解，引起该处血管内皮细胞(vascular endothelial cells， VEC)分裂增殖形成幼芽，继而生成新生血管。提示BMCs参与炎症性CV[7]。此外，将bFGF的缓释剂植入角膜板层囊袋中，也可以诱导CV。CV中>90%的BMCs分化的周细胞可表达CD45和CD11b[6-7]。另有研究显示17.7%的VEC和53%的周细胞是源于CV中的BMCs，而BMCs在CV初始阶段即到达新生血管处。提示BMCs在CV早期就起到关键作用，如果在早期进行干预，那么对于CV的预后将起到重要作用。

1.2BMCs和视网膜新生血管(retinal neovascularization， RNV) RNV是增生性血管病的主要并发症，如糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy， DR)和早产儿视网膜病变。视网膜局部缺血或损害是RNV的主要特点，Grant等[8]研究表明BM中HSCs能分化成所有参与RNV发病机制的造血细胞系，在缺血性病变区聚集。另一项研究也证实了视网膜受损后，BMCs靶向黏附于星形胶质细胞，表现出典型的ECs外观和特点[9]。此外，在激光损伤模型和氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy， OIR)模型[10]中RPE细胞分泌大量的SDF-1参与BMCs迁移和黏附。在手术切除DR患者的视网膜前膜中有大量表达CD133+EPCs和CD14+白细胞，这意味着BMCs参与到了RNV中。

1.3BMCs和脉络膜新生血管(choroidal neovascularization， CNV) CNV是多种眼部疾病所共有的病理体征。大量临床标本和动物模型研究表明CNV中有BMCs的参与。老年黄斑变性患者手术切除的CNV膜中，发现了AC133阳性细胞标记的EPCs和HSCs[11]。特发性CNV和病理性近视相关CNV的形成均与干细胞的活动有关[12]。CNV中表达的BMCs明显高于眼部其他组织，提示BMCs可特异性在CNV区富集，参与血管形成[1]。其前期研究也表明，CNV中BMCs分化为血管细胞沿新生血管的管腔分布，激光诱导小鼠CNV初期即可观察到大量的BMCs聚集，观察BMCs参与CNV动态的全过程，发现CNV后第7天病损区BMCs数量达高峰，随后缓慢下降，到1月余BMCs数量趋于平稳[1]。而BM中的单核巨噬细胞从造模后早期第7天起就持续存在于病损区及眼部其他组织中。用特异性内皮细胞标志物CD31染色，发现大量的CD31聚集在此。提示CNV区域内的BMCs可能分化为VEC参与血管的形成[1]。此外，CNV区域还有血管平滑肌细胞的标志物，如α-平滑肌激动蛋白、结合蛋白、NG2硫酸软骨素黏蛋白或单核巨噬细胞标记物F4/80[13]，提示CNV区域中BMCs还可以分化为VEC、VSMCs和单核巨噬细胞等来参与血管的生成。

2 BMCs对眼部新生血管调节机制

眼部新生血管中BMCs分布的比例和作用时间是不同的，但他们也有一些相似之处。例如它们参与眼部新生血管的发育，均包括4个步骤：动员、迁移、黏附和分化，在这一过程中受到多种细胞因子和信号通路的调控。

2.1BMCs在眼部新生血管中的动员 当机体在缺氧或受到各种损伤等因素的刺激下，BMCs会加速趋化至损伤部位，参与局部组织缺血损伤的发生[14]。BMCs可通过分泌VEGF，发挥对BMCs的动员作用。使BM微环境从静态转变为激活状态，同时VEGF的升高也带动BMCs活化加速，粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)和促红细胞生成素(erythropoietin， EPO)水平也开始增加。此外，SDF-1和其特异性受体CXCR4结合可以加强BMCs的活化作用，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)9在促进BMCs的动员过程中发挥重要的作用。

G-CSF通过对细胞本身和BM环境的调控起到动员作用[15]。其可通过影响HSCs的表达，减少HSCs的凋亡，从而使BM环境中ECs黏附分子的表达下降，增加基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases， MMPs)释放和ECM降解，促进BMCs移行到BM外[15]。此外，也有报告称G-CSF减少了BM中血管内皮细胞黏附分子的表达，刺激了MMPs的释放和ECM的退化。在CV中，G-CSF表达的增强促进了EPCs从BM进入血液循环[6-7,16]。

EPO可以刺激BM中EPCs生成。有研究发现，心肌梗死心力衰竭时，EPO水平上升，增加了周围血液的EPCs数量[17-18]。另有研究显示，OIR小鼠模型中显示无血管区域EPO水平被抑制。提示早期使用EPO可以防止缺氧诱导的视网膜神经元凋亡，而晚期使用EPO则会促进新生血管的生成，加速视网膜神经元的凋亡。这表明EPO在BMCs参与血管生成开始时，就进入RNV中发挥动员和募集的作用[19]。

2.2BMCs在眼部新生血管中的迁移 VEGF、SDF-1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)和MMPs在调节BMCs的迁移过程中起到了重要作用，但具体的分子机制较为复杂，现尚未研究清楚。

趋化因子和它们的受体在BMCs迁移过程中起到了重要作用。如VEGF和其趋化因子VEGF-A；SDF-1和趋化因子CXCR4和CX3CR1。事实上，SDF-1和VEGF之间及CXCR4和VEGF之间呈正相关关系。也就是说，一种因子表达上调，另一种因子也会相应增高。此外，在肿瘤相关的研究中，发现SDF-1和VEGF协同，可诱导BM来源细胞的迁移[20]。

在RNV和CNV模型中，SDF-1和CXCR4可诱导EPCs、HSCs和MSCs聚集于眼部新生血管区域，而CXCE4拮抗剂会明显减少BMCs的聚集[5,20]。在低氧诱导的RNV模型中，RPE层中缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1， HIF-1)与SDF-1相互作用、相互影响，从而促进更多的BMCs迁移到眼部参与新生血管形成。

TNF-α作为一种特异性的炎性因子表达于炎性组织中。在CV的研究中发现，TNF-α缺失后更多的单核巨噬细胞侵入到炎症部位，增强了眼部新生血管管腔的形成及角膜瘢痕的形成[21]。另一项研究证明了在BM源性炎性细胞中选择性表达的TNF-α受体1b，诱导信号正向调节炎性细胞侵入，促进CNV中的血管生成[21]。

MMPs在调节BMCs的迁移过程中起到了重要作用。眼部组织分泌多种酶类物质，如MMP-2、MMP-7、MMP-9及MMP-13等参与细胞的移行，降解细胞外基质，促进新生血管出芽，从而促进BMCs趋化迁移至新生血管部位[22]。CNV发生过程中，TGF和VEGF表达上调，引起MMPs表达增高，而基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase 1， TIMP-1)增加的不明显，破坏了MMPs与TIMP-1之间的平衡，增加了ECM的裂解，促进了BMCs的移行，VEC增生及管腔的形成。

2.3BMCs在眼部新生血管中的黏附 BMCs的黏附主要是通过血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)、细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管内皮细胞钙黏蛋白、SDF-1和整合素来调节。多种黏附因子与相应配体结合，介导BMCs的黏附过程。BMCs在CNV上大量分布，多种因子如VCAM-1和ICAM-1的表达明显增高[10]。提示这些黏附因子在BMCs参与眼部新生血管黏附中发挥重要作用。在CNV模型中，整合素与多种细胞因子VEGF、血小板衍生生长因子、bFGF及MMPs等，介导BMCs向细胞间和ECM的移行、黏附。而整合素拮抗剂可抑制VEC与ECM的黏附，进而阻止VEC移行和增生，目前已成为临床上重要的新生血管抑制剂之一。

2.4BMCs在眼部新生血管中的分化 大多数BMCs在到达眼部新生血管区域后分化为ECs、VSMCs和单核巨噬细胞。一些在穿过玻璃膜疣之前，到达脉络膜血管内时就已经完成了分化。有研究表明，在角膜、视神经盘和没有新生血管的虹膜中也发现了一些BMCs；有些表现出树枝状且F4/80阳性，表明眼部的BMCs除了对眼部新生血管的作用，还有其他功能[1]。

不同的微环境诱导了BMCs向不同方向分化，而BMCs在眼部新生血管中的作用现仍未阐明。在新生小鼠视网膜神经元的微环境中，BMCs被诱导分化为多种细胞因子以及参与未知信号通路[9-10,12]。此外，在RNV和视网膜退化疾病中，移植到视网膜下腔静脉的BMCs分化成为血管ECs和感光细胞，对血管的发育和神经元的保护有着很大的影响[23]。

近期研究发现Notch信号不仅能抑制或刺激尖端细胞的形成，也能影响EPCs的活化、增生和分化[24-25]。有研究表明，在缺血性新生血管中，Notch信号Jagged-1，调节Notch信号来刺激EPCs向ECs分化，增强了新生血管的生成[25]。而CNV的小鼠模型研究表明，Notch受体的转录因子下游重组细胞结合蛋白-Jκ的缺乏，是通过调节EPCs分化为ECs诱导了血管损伤，提示转录因子下游重组细胞结合蛋白-Jκ介导Notch信号可能在一定程度上通过影响EPCs分化，参与了眼部血管稳态的维持[25-27]。

3 BMCs对眼部新生血管微小RNA(miRNA)作用

miRNA可以调节BMCs的生理功能，在骨髓干细胞中特异性的表达[1，28]，改变干或祖细胞的性质，可明显升高或降低miRNA的表达[1]。项阳和姜明红[29]利用小鼠实验，证明了在脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导炎症状态下，miRNA-146a表达失常导致单核巨噬细胞功能紊乱。

我们研究小组建立嵌合体小鼠CNV模型后发现，BMCs对CNV生成时MMP-2/MMP-13的迅速上调起主要作用。同时证实了CNV中BMCs内miR188-5p的表达亦随时间变化。通过双酶报告基因实验证实miRNA-188-5p可能是MMP-2和MMP-13的靶基因[12]。研究miRNA-188-5p的作用及其与CNV中BMCs MMP-2和MMP-13的关系，发现miRNA-188-5p可能会通过调控ECM中色素上皮衍生因子的降解，从而调节MMP-2和MMP-13表达，VEC增生、移行、凋亡及CNV纤维化，从而影响CNV的严重程度。另外，还发现在嵌合体小鼠CNV模型中，BMCs对CNV生成时SDF-1和CXCR4的迅速上调起主要作用[12]。

4 影响BMCs作用于眼部新生血管风险因素

一些新生血管疾病的风险因素如衰老、吸烟、高血糖及炎症等往往会改变BM的微环境，影响BMCs参与新生血管发生和发展。眼部新生血管风险因素对眼部新生血管有一定作用，尤其是对CNV。

4.1衰老 年龄是增加CNV发病的重要因素[1]。有研究表明，高龄CNV小鼠较低龄CNV小鼠的CNV体积、面积明显增多，且BMCs分化的血管平滑肌细胞明显增多。此外，该研究还发现高龄CNV小鼠较低龄CNV小鼠BMCs分化的VEC数量则无明显增减[2]。近期我们的实验室使用体内生物荧光成像，也表明了衰老的BMCs使得CNV更加严重[12]。

4.2吸烟 吸烟是老年黄斑变性中最重要的风险因素，能促进BMCs参与CNV的发育。有学者在小鼠CNV模型中发现香烟中微颗粒主要成分尼古丁会增加CNV的严重程度[20]。一项研究也表明了尼古丁可通过VSMCs中乙酰胆碱受体的调节诱导VEGF释放，此过程是由表皮生长因子受体胞外信号调节激酶通路调节[30]。另有研究也表明尼古丁促进了BMCs到CNV中的聚集、趋化并对BMCs分化有影响，是通过VEGF、bFGF和血管内皮细胞黏附因子1的上调来影响的[20,30]。表明尼古丁对BMCs在CNV作用的间接影响，可能是通过其他因素调节的。然而未来还需要进行更多关于机制的研究。

4.3高血糖 高血糖也被认为是眼部新生血管和视力丧失的风险因素。DR是20～74岁美国人群中视力丧失的最普遍原因。有研究发现小鼠CNV模型中有大量BMCs聚集于损伤处，并证明了患有糖尿病的小鼠中BMCs更多地聚集到CNV处[31]。ECs标记和单核巨噬细胞标记的BMCs比例上升，VEGF和CNV中SDF-1因子上调。此外，将MSCs转移到人RPE细胞中，VEGF与SDF-1的表达在高血糖时增加[31]。提示高血糖增强了RPE细胞中VEGF和SDF-1的表达，促进了BMCs的聚集，影响CNV中BMCs的分化，增加了糖尿病小鼠CNV的严重程度。另有研究显示，高血糖诱导的氧化应激促进了STAT3的活性，使VEGF转录活化，从而间接促进了BMCs参与CNV，加重CNV的严重程度[32]。

4.4炎症 BMCs上表达大量炎性介质，且炎症在CNV中起到重要的作用[33]。有研究表明，单核巨噬细胞缺损的基因敲除鼠行激光诱导CNV后，损伤部位有大量来源于BM的单核巨噬细胞聚集，且分析后发现基因敲除组的CNV面积、体积、厚度较对照组有明显减少[26]。提示炎性介质在BMCs参与眼部新生血管的发生和发展中有重要作用[34]。此外，有研究表明中性粒细胞及T淋巴细胞在CNV中同样发挥着重要作用[26,34]。

总之，大量证据表明BMCs在眼部新生血管发病机制中起到了关键作用[35]，分为动员、迁移、黏附和分化4步。多种细胞因子如SDF-1、TNF-α、VEGF及MMPs等可用于BMCs的靶向治疗。BMCs参与眼部新生血管的风险因素对预防眼部新生血管的发生起到重要作用。对BMCs参与眼部新生血管机制的深入理解，有助于探讨靶向优化的治疗方案。本文详细综述了BMCs在眼部新生血管发育中的重要作用，涉及到抗血管内皮生长因子以及未来抗血管生成疗法。然而，眼部新生血管的退化，如RNV和CNV，几乎不会是永久的，若没有抗血管内皮生长因子抑制剂的多重使用，几个月后会观察到新血管的再生[35-36]。至今，极少有研究调查过眼部新生血管复发时BMCs作用潜在的功能和机制。如果能解决这个问题，可能对BMCs结合抗血管生成治疗靶向治疗有帮助。此外，眼部新生血管的诊断常常建立在新生血管形成之后，有时甚至伴随着分泌物和出血。BMCs从BM活化并转移至周围血液循环，在新生血管形成前就到达损伤处。这些研究使我们猜测BMCs和相关细胞因子是否能作为潜在标志，来协助眼部新生血管的早期诊断。目前许多相关发病机制仍需更进一步研究。总的来说，带着这些问题能更深刻地帮助我们提高对眼部新生血管中BMCs影响的潜在调节机制的理解，有望在未来扩大BMCs的临床应用和治疗用途。将BMCs作为靶点或载体不仅可应用到眼部，还可应用到身体其他部位。