不同水深地雷爆炸对脊髓损伤特点及机制研究

张成生，张志龙，马 骁，王 鹏，刘 成，韩庚奋

浅滩登陆作战遭遇地雷爆炸时因水下冲击波会造成严重损伤，水下冲击波的传播特点是峰值超压较高、正压持续时间较短[1]。水下冲击波强度远远高于空气中，且传播速度快、能量损耗少，致死范围较大[2]。同质量同距离的地面爆炸与水下爆炸相比，峰值压力可相差200倍左右[3]。浅滩地雷爆炸的损伤特点和机制可能与陆地不同；冲击波传导的机制及强度可能因水深的不同而不同。既往研究表明，浅滩区触雷爆炸肢体局部软组织损伤较陆地轻，但是骨骼损伤较陆地触雷爆炸明显严重[4]。水下地雷爆炸的冲击波除引起局部损伤，还会引起远处脏器或组织的损伤，由于冲击波在气体-液体界面产生剪力波，导致附近组织及脏器严重损伤，由于椎管和脊髓密度差别较大，可因剪力波及瞬间加速度而损伤脊髓。因此，研究浅滩区肢体触雷爆炸造成的脊髓损伤特点及机制，为两栖登陆作战触雷爆炸伤的救治和防护提供依据十分必要。

1 材料和方法

1.1实验动物分组 新西兰大白兔64只，由中国人民解放军陆军军医大学附属大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。实验动物使用批准证书：SYXK(渝2017-0005)。使用品红溶液于兔耳内外侧直接标号进行编号，随机分为对照组、陆地组、浅水组、深水组，每组16只。浅水组水深至新西兰大白兔膝关节；深水组水深至新西兰大白兔第3腰椎(L3)。

1.2动物致伤及标本取材

1.2.1动物致伤：所有新西兰大白兔通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg进行麻醉，麻醉平稳后将其固定于塔形金属支架，支架与水平面成约75°角，将新西兰大白兔俯卧位置于支架一侧，使其成半直立状态，右后肢着地，左后肢呈屈曲状态。将600 mg 三硝基甲苯(TNT)防水处理后，置于新西兰大白兔右后肢，然后电引爆。致伤后立刻给予止血、包扎。观察时间为12 h。

1.2.2标本取材：伤后3、6、12 h分别抽4组大白兔取动脉血3 ml，血液在1500 g离心力下离心10 min，提取上清，超低温冰箱保存。伤后12 h沿新西兰大白兔腰背部切一纵形切口，分离肌肉，咬骨钳咬除棘突及两侧椎弓根，充分暴露椎管，取L3～4脊髓，部分用于Western Blot 检测，置于冻存管，立刻放于液氮罐中保存；部分使用4%多聚甲醛固定，用于病理学检查。

1.3病理切片制作及染色步骤 将固定好的标本用蒸馏水稍洗后，脱水，透明，石蜡包埋，切片机切为厚度4 μm。苏木精染色3 min， 0.6%盐酸乙醇分化30 s，1%醇溶性伊红染色2 min，之后使用浓度为80%、95%、100%乙醇各浸泡2次，每次浸泡2 min。使用二甲苯透明，中型树胶封片。

1.4脊髓胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein， GFAP)蛋白含量 采用Western Blot进行检测：将脊髓样品放在研钵中研磨后分装在离心管中。将酶蛋白抑制剂混合物与组织蛋白抽提试剂按照1∶99混合，每个样品中加入250 μl，在沸水中煮10 min，1200 r/min，4℃离心5 min。取上清，分装于0.5 ml的离心管中，将玻璃板先后用洗涤剂、无水乙醇清洗，待干燥后固定于垂直电泳槽上，用0.8%琼脂糖密封玻璃板边缘；配制分离胶，灌胶。加入足够的电泳液后，上样，每泳道加入50 μg的总蛋白。电泳完毕后，剥胶，留取具有目的蛋白的分离胶，用于转膜，转膜条件为250 mA，2 h。之后使用脱脂奶粉封闭，37℃摇床上摇动封闭1 h；PVDF膜漂洗后，一张加入多克隆山羊抗兔GFAP抗体溶液(稀释浓度为1∶1000)；另一张加入GAPDH抗体溶液(稀释浓度为1∶2000)，4℃冰箱中孵育过夜。弃去一抗溶液，分别浸入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(稀释浓度1∶10 000)溶液中，在37℃恒温振荡器中孵育2 h。之后，弃去抗体溶液，使用PBST溶液脱色摇床洗膜5次，每次5 min。显色后使用Quantity one 4.6.2软件进行蛋白条带灰度分析。

1.5中枢神经损伤标志物检测 采用蛋白免疫吸附试验(ELISA)检测神经元特异性烯醇酶(neuron-specific enolase， NSE)和髓磷脂碱性蛋白质类(myelin basic protein， MBP)：配制标准品液，在酶标包被板上加入稀释好的标准品或兔动脉血清100 μl，将反应板充分混匀后置于37℃温育20 min；洗涤；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μl，空白孔除外。将反应板充分混匀后置于37℃温育40 min；弃去液体，洗涤；每孔加酶标抗体工作液100 μl，将反应板置于37℃ 15 min。弃去液体，甩干，洗涤。每孔加入底物工作液100 μl，置于37℃暗处显色15 min。取出酶标板，每孔加入100 μl终止液，充分混合均匀；在450 nm波长下测量每个孔的吸光度值。同法检测MBP。

1.6生物力学测试 取陆地组、浅水组、深水组新西兰大白兔共48只，将压力传感器布放于其的L3椎管内，加速度传感器固定于L3横突。测试L3椎管内冲击波压力峰值和加速度峰值。使用TST6150采集仪采集信号，DAP6.01软件分析。

2 结果

2.1兔脊髓损伤大体形态变化 地雷爆炸后陆地组脊髓未发现异常，见图1A。浅水组蛛网膜下腔出血发生率为43.75%(7/16)，见图1B。神经根周围点状出血发生率为12.50%(2/16)，见图1C。深水组脊髓挫伤发生率为37.50%(6/16)，损伤均发生在水平面附近的脊髓，见图1D；神经根周围点状出血发生率为62.50%(10/16)，蛛网膜下腔出血发生率为25.00%(4/16)，见图1E。

图1 各致伤组新西兰大白兔脊髓损伤的大体形态观察

A.陆地组脊髓无异常；B.浅水组蛛网膜下腔出血；C.浅水组神经根周围的点状出血；D.深水组脊髓胸段的挫伤；E.深水组蛛网膜下腔出血

2.2兔脊髓病理形态变化 对照组脊髓未见异常；陆地组脊髓神经元细胞水肿变性，核仁不清；浅水组可见神经元细胞水肿变性、及红细胞渗出；深水组可见神经元细胞水肿变性及大量红细胞渗出。见图2。

图2 各组新西兰大白兔脊髓病理变化(HE×400)

A.对照组；B.陆地组；C.浅水组；D.深水组

2.3兔脊髓及脑皮质GFAP蛋白含量比较 浅水组、深水组脊髓及脑皮质GFAP蛋白表达水平高于对照组及陆地组(P<0.05)；浅水组与深水组、陆地组与假致伤组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3和表1。

图3 各组新西兰大白兔脊髓及脑皮质GFAP蛋白含量

GFAP为胶质纤维酸性蛋白，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.5高速摄像下爆破情景 陆地组起爆后1 ms可见巨大的火球向四周扩散。浅水组并未形成起泡，而是在起爆后2 ms爆炸气体直接冲出水平面，形成水柱。深水组起爆后3 ms形成一气泡，气泡快速扩大，并产生冲击波损伤肢体，气泡快速上升，56 ms后冲出水面。见图4。

表1 4组新西兰大白兔致伤后兔脊髓GFAP蛋白印迹灰度变化

注：GFAP为胶质纤维酸性蛋白，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与对照组比较，aP<0.05；与陆地组比较，cP<0.05

2.4中枢神经损伤标记物表达水平比较

2.4.1NSE水平比较： 4组伤前及对照组伤前和伤后3、6、12 h的NSE水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，陆地组、浅水组、深水组伤后3、6、12 h的NSE水平均高于伤前(P<0.05)。伤后3 h浅水组和深水组NSE水平高于对照组和陆地组(P<0.05)。陆地组和对照组NSE水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。伤后6、12 h陆地组、浅水组、深水组NSE水平均高于对照组，且深水组高于浅水组和陆地组，浅水组高于陆地组(P<0.05)。见表2。

表2 4组新西兰大白兔动脉血清NSE表达水平

注：NSE为神经元特异性烯醇化酶；与伤前比较，aP<0.05；与对照组比较，cP<0.05；与陆地组比较，eP<0.05；与浅水组比较，gP<0.05

2.4.2MBP水平比较：4组伤前MBP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组伤前和伤后3、6、12 h的MBP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。陆地组、浅水组、深水组伤后3、6、12 h的MBP水平均高于伤前(P<0.05)。陆地组、浅水组、深水组伤后3、6、12 h的MBP水平均高于对照组，且深水组高于浅水组和陆地组(P<0.05)。浅水组和陆地组伤后3、6、12 h 的MBP 水平比较无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 4组新西兰大白兔动脉血清 MPB表达水平比较

注：MBP为髓鞘碱性蛋白；与伤前比较，aP<0.05；与对照组比较；cP<0.05；与陆地组比较，eP<0.05；与浅水组比较，gP<0.05

图4 高速摄像下爆破情景

A.陆地组起爆后1 ms；B.浅水组起爆后2 ms；C.深水组起爆后20 ms

2.6生物力学检测比较 深水组椎管内压力峰值均高于浅水组及陆地组(P<0.05)，浅水组椎管内压力峰值与陆地组比较无统计学意义(P>0.05)。深水组的椎体加速度峰值均高于浅水组及陆地组，且浅水组椎体加速度高于陆地组(P<0.05)。见表4。

表4 3组新西兰大白兔生物力学测试结果比较

注：与陆地组比较，aP<0.05，与浅水组比较，cP<0.05

3 讨论

爆炸伤多由于脏器伤情严重而掩盖了脊髓损伤的表现。脊髓爆震伤是爆炸后脊髓损伤的主要类型,其损伤从细胞水平观察主要表现为细胞凋亡[5]。爆炸冲击波可导致脊髓硬膜外出血，如不能早期发现快速治疗，易发生较高的致残率和病死率[6]。如果能早期判断伤情特点，及时分类后送，在尽可能短的时间内积极治疗，对于伤员后期的功能恢复具有重要的意义。

本研究结果显示，浅水组蛛网膜下腔出血发生率高于深水组；深水组出现脊髓的挫伤，且挫伤多发生与气-液平面，但浅水组却未见此种损伤特点。陆地组肉眼观察未见异常，这证明浅水组和深水组脊髓损伤较陆地严重，且浅水组和深水组的损伤特点不同。深水组地雷爆炸，由于水的密度较大且不可压缩，冲击波损耗较小，强度较大，较陆地有更严重的破坏效应，所以损伤较浅水组及陆地组严重。生物力学测试结果表明，深水组椎管内压力峰值和加速度峰值均高于浅水组及陆地组，与上述伤情相一致。深水组出现脊髓的挫伤，且挫伤多发生在气-液平面，但浅水组却未发现。笔者认为主要原因是水与空气密度不同，在交界面发生剪力所致损伤。浅水组脊髓损伤主要表现为蛛网膜下腔出血及神经根周围的点状出血。二者损伤特点不同，与爆炸损伤的机制不同相关，高速摄像提示深水组起爆后3 ms形成气泡，气泡快速扩大，并快速上升，56 ms后冲出水面；而浅水组并未形成起泡，而是在起爆后2 ms爆炸气体直接冲出水平面，形成水柱，这充分说明不同水深的爆炸损伤机制不同。 此外，生物力学测试表明，浅水组椎管内压力峰值与陆地组无明显差别，而加速度峰值明显高于陆地组，说明浅水爆炸的脊髓损伤主要因瞬间加速度所致，这可能与水柱的产生有关。

冲击波可损伤脊髓内血管而造成脊髓出血、缺血性损伤，脊髓损伤主要是白质结构的异常、水肿及脱髓鞘改变，以及神经元细胞核浓聚、偏位甚至破裂[7]。高压空气冲击波在脊髓实质内产生拉伸、压缩和剪切力，从而导致广泛的轴索损伤，主要表现出三种不同的病理形式:微管断裂、神经丝致密化和钙蛋白酶介导的血影蛋白破坏[8]。郭大兴等[9]研究表明冲击波超压峰值为3 MPa时脊髓病理可见大量散在的出血坏死灶，可造成大鼠双后肢运动诱发电位潜伏期延长或波幅下降。本研究中光镜下观察陆地组脊髓神经元细胞仅见水肿变性，核仁不清。浅水组可见前角运动神经元细胞水肿变性，及红细胞渗出。深水组可见脊髓前角大量红细胞渗出。病理学检查证明浅水区地雷爆炸后脊髓的严重损伤。脊髓损伤由于轴突和神经细胞的变性、凋亡，而失去感觉、运动和自主功能。脊髓受冲击伤后自由基产生增多，如脊髓内丙二醛，白介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等，这些物质使脊髓细胞坏死凋亡进一步发展[10]，诱导一系列生化反应引起脱髓鞘改变。轴突的变性和周围的免疫反应被称之为“二次损伤”。脊髓的二次损伤会进一步影响突触重塑及神经环路再生,成为脊髓损伤修复的主要障碍之一[11]，如及时治疗可能会减轻“二次损伤”。脊髓损伤后常使用甲基强的松龙抑制炎症反应，以减少对脊髓的二次损害[12]。静脉注射甲强龙能够有效缓解脊髓损伤急性神经痛，阻止急性神经痛转变为难治性慢性神经痛，能够显著改善患者的生活质量[13]。因此，在后送和治疗中必须给予高度关注，力争做到早诊断，早治疗。

本研究结果显示，致伤后浅水组及深水组GFAP、NSE、MBP表达水平较陆地组明显增高，与显微组织形态观察结果相一致。证明不同水深的地雷爆炸脊髓损伤均较陆地地雷爆炸严重。中枢神经系统神经元细胞的损伤可能会导致一些蛋白渗漏，如果有血脑屏障被破坏，这些蛋白会进入外周血液。在创伤性中枢神经损伤患者的血清中，这些蛋白的浓度通常会增高。急性脊髓损伤患者的血清NSE 蛋白水平均显著高于未伴脊髓损伤及正常人群，且其血清水平 24 h 达到峰值，随后逐渐降低[14]。血清 NSE>6.26 ng/ml 时提示可能出现了脊髓损伤[15]。血清 NSE 结合 CT 检查可预测急性脊髓损伤的严重程度[16]。

GFAP主要表达在纤维性星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞，对神经元的存活和胶质细胞的增生有促进作用，其表达水平的高低可反映星形胶质细胞增殖、坏死等改变的程度，是早期诊断中枢神经损伤的可靠指标[17]。本研究结果显示，兔脊髓GFAP、NSE和MBP蛋白含量，损伤最为严重的是深水组，其次是浅水组，陆地组损伤不明显。这说明水越深，爆炸对脊髓的损伤越严重。脊髓损伤后，一方面星形胶质细胞表达GFAP，自我复制有利于损伤修复和功能恢复；另一方面，因过度胶质化形成的胶质瘢痕影响了神经结构修复和神经功能恢复。由于受损的神经元的轴突末梢GFAP含量增加， GFAP的合成可促进形成胶质瘢痕。脊髓损伤后损伤脊髓组织中 GFAP 的表达增加，损伤后14 d 达到最高[18]。早期减少GFAP的合成可阻止胶质瘢痕的形成。有学者通过下调GFAP的表达水平从而达到临床治疗的目的。Toyooka等[19]将siRNAs 导入GFAP抑制胶质活性发现可以改善急性排尿功能障碍，证明下调GFAP等蛋白活性，抑制星形胶质细胞的过度增殖，可以有效的治疗脊髓损伤。王芳等[20]研究结果表明，干细胞通过促进兔损毁侧交感神经节内微管相关蛋白-2的表达,同时抑制GFAP的表达来发挥神经功能的修复作用。薛成莲等[21]通过给予急性脑梗死患者采取阿替普酶静脉溶栓及银杏叶提取物注射液治疗，结果表明可下调血清GFAP水平，提高疾病整体治疗效果。GFAP与脑损伤严重程度和死亡相关，通过检测GFAP可预测脑损伤程度及病死率。本研究中浅水区地雷爆炸伤对脊髓的损伤较陆地严重，伤后GFAP表达增强，通过对GFAP的检测可为临床诊断和治疗提供指导。

综上所述，不同水深的地雷爆炸会导致严重的脊髓损伤，包括蛛网膜下腔出血、神经根周围出血及脊髓的挫伤等表现；且不同水深的地雷爆炸损伤机制不同，伤情特点也不同。脊髓损伤的治疗十分复杂，因此在后送和入院治疗时要考虑到脊髓损伤的特点，要尽早进行检查和治疗，确保功能的恢复。