miR-374b-5p靶向调控ING1表达及对乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移的影响

李 霞，任玉嫄，林 洁，周 琦

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，是全球女性肿瘤相关死亡的主要原因。流行病学数据显示，2018年全世界有210万左右新诊断乳腺癌病例，约占女性肿瘤病例的25%；在我国乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1-2]。近年来，乳腺癌诊断和治疗取得了重大进展，但患者的预后仍很差[3]。乳腺癌患者死亡的主要原因是肿瘤的恶性增殖和转移[4-5]，因此，研究乳腺癌的潜在机制、开发用于治疗乳腺癌的新型治疗靶标对改善患者预后具有重要意义。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)几乎在所有类型的肿瘤中均具有关键作用，miRNAs是一组长度为21～23个核苷酸的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与了细胞增殖、分化和凋亡等重要过程；其可作为致癌基因和抑癌基因在肿瘤发生发展中起着重要作用，被认为是潜在的肿瘤诊断标志物和肿瘤治疗靶点[6-7]。在乳腺癌中已经鉴定了许多异常表达的miRNAs，是乳腺癌恶性生物学行为的关键调控者。miR-374b-5p在多种肿瘤中表达异常[8-10]，Chang等[11]报道，miR-374b-5p在乳腺癌患者全血中表达增加。miR-374b-5p参与乳腺癌的发病机制尚不清楚，因此本研究采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测了miR-374b-5p在乳腺癌组织和细胞中的表达，并通过体外抑制乳腺癌细胞中miR-374b-5p的表达后，观察细胞增殖、侵袭和凋亡的变化，探讨miR-374b-5p参与乳腺癌发病的可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料 选择2015年12月—2017年12月我院行手术治疗的乳腺癌患者，患者术前均未接受化疗、放疗、靶向和内分泌等任何形式的治疗；组织经病理专家证实为乳腺癌。共收集50例乳腺癌标本。所有操作均符合我院伦理委员会制定的相关规定，本研究已获得委员会的批准。

1.2试剂与仪器 TRIzol、PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录和SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；miR-374b-5p、U6、生长抑制因子1(inhibitor of growth 1, ING1)和GAPDH引物均由上海捷瑞生物有限公司设计合成；乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937和正常乳腺细胞系MCF 10A均购自美国ATCC细胞库；RPMI-1640、L-15、DMEM-F12培养基及胎牛血清FBS均购自美国Gibco公司；miR-374b-5p inhibitor和miR-374b-5p mimic均购自广州市锐博生物科技有限公司；MTS购自美国Biovision公司；6孔板和Transwell小室等均购自美国Corning公司；Boyden基质胶购自美国BD公司。

1.3qRT-PCR 采用TRIzol裂解氯仿提取法获得组织和细胞中的总RNA。按照反转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按qRT-PCR试剂盒说明进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃预变性5 s，95℃变性5 s、60℃退火30 s，共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-374b-5p的相对表达量；以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算ING1 mRNA的相对表达量。引物序列分别为miR-374b-5p：F:5′- TCAGCGGATATAATACAACCTGC-3′, R:5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3′。U6: F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAING1-3′, R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 ING1:F: 5′- AACAACGAGAACCGTGAGAAC-3′, R:5′-TGGTTGCACAGACAGTACGTG-3′。内参GAPDH: F: 5′- ACAACTTTGGTAT CGTGGAAGG-3′, R:5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.4细胞培养及转染 将MCF-7和MCF 10A细胞接种于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，MDA-MB-231细胞接种于含10% FBS的L-15培养基中，HCC1937 细胞接种于含10% FBS的DMEM-F12培养基中，培养均在37℃、5%CO2培养箱中进行。根据qRT-PCR结果，选取miR-374b-5p表达水平最高的乳腺癌细胞用于转染，细胞融合度为90%时，胰酶消化以2×105个/孔接种于6孔板中，分为对照组和miR-374b-5p inhibitor组，按照说明书将试剂转染至细胞中，细胞转染48 h后采用qRT-PCR验证miR-374b-5p inhibitor沉默效果。对照组的序列为 5′-CAGUACUUUUGUGUA UACAA-3′； miR-374b-5p inhibitor组的序列为 5′-CACUUAGCAGGUUGUAUUAUAU-3′。

1.5MTS增殖实验 细胞生长至对数期时，胰酶消化以3000个/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，按照转染说明书将对照组和miR-374b-5p inhibitor转染至细胞中，继续培养72 h，弃掉培养基，每孔加入100 μl培养基和20 μl MTS工作液(MTS∶PMS=20∶1)，置于细胞培养箱孵育2 h，全波长酶标仪检测490 nm波长处样品OD值。细胞增殖抑制率= (miR-374b-5p inhibitor组OD值-对照组OD值) /对照组OD值×100%。

1.6Boyden实验 45 μl BD基质胶铺至Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，放置细胞培养箱中使胶由液体变为固态备用，收集转染48 h后的各组细胞胰酶消化计数，无血清培养基洗3次，细胞浓度调整为1×106个/ml，100 μl细胞悬液接种于Transwell小室基质胶上，500 μl完全培养基加入下室作为趋化因子，放置培养箱中培养，细胞通过基质胶穿过聚碳酸酯膜小孔，下室穿过10个细胞时终止培养，PBS将微孔膜上室面细胞洗掉，甲醇固定15 min，苏木素染色20 min。随机计数显微镜下5个视野的穿膜细胞数，并拍照。

1.7Transwell小室实验 收集转染48 h后的各组细胞胰酶消化计数，无血清培养基洗3次，细胞浓度调整为1×106个/ml，100 μl细胞悬液接种于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上室面上，500 μl完全培养基加入下室作为趋化因子，放置培养箱中培养，细胞直接穿过聚碳酸酯膜小孔，下室穿过10个细胞时终止培养，PBS将微孔膜上室面细胞洗掉，甲醇固定15 min，苏木素染色20 min。随机计数显微镜下5个视野穿膜细胞数，并拍照。

1.8miR-374b-5p靶向调节ING1 本研究采用TargetScan7.1软件(http://www.targetscan.org/)预测miR-374b-5p的靶基因。双荧光素酶报道基因实验分别将以下4组共转染到细胞中：ING1-wt(野生型)与miR-374b-5p mimic共转染组(ING1-wt+miR-374b-5p)；ING1-wt与对照共转染组(ING1-wt+NC)；ING1-mut(突变型)与miR-374b-5p mimic共转染组(ING1-mut+miR-374b-5p)；ING1-mut与NC共转染组(ING1-mut+对照)，收集转染48 h的细胞，根据双荧光素酶报道基因检测试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性。

2 结果

2.1qmiR-374b-5p在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平 miR-374b-5p在乳腺癌组织中的表达为1.82±1.01，癌旁组织中的表达为1.04±0.53；乳腺癌组织中miR-374b-5p的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1A。miR-374b-5p在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937中的表达水平分别为21.62±2.45、5.72±0.68、10.58±0.93，miR-374b-5p在正常乳腺细胞系MCF 10A中的表达水平为1.00±0.00。miR-374b-5p在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937中的表达水平显著高于正常乳腺细胞系MCF 10A，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1B。因此选取表达水平最高的MCF-7细胞用于后续实验。

图1 miR-374b-5p在乳腺组织和乳腺细胞系中的表达水平比较

A.乳腺癌组织和癌旁组织中miR-374b-5p表达；B.miR-374b-5p在乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系中的表达；与癌旁组织比较，aP<0.05；与MCF 10A细胞系比较，cP<0.05

2.2转染miR-374b-5p inhibitor的干扰效果比较 miR-374b-5p inhibitor转染MCF-7细胞48 h后，miR-374b-5p在miR-374b-5p inhibitor组细胞中的表达水平为0.21±0.04，在对照组细胞中的表达水平为1.00±0.05，2组miR-374b-5p表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明miR-374b-5p inhibitor明显干扰了MCF-7细胞中miR-374b-5p的表达，可进行后续实验。

2.3干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞增殖的影响 对照组细胞增殖率为(100.00±5.00)%，miR-374b-5p inhibitor组细胞增殖率为(29.30±4.27)%；与对照组比较miR-374b-5p inhibitor组细胞增殖率降低(P<0.05) 。见图2。

图2 干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞增殖的影响

与对照组比较，aP<0.05

2.4干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞侵袭的影响 对照组细胞穿膜数为(52.34±11.14)个，miR-374b-5p inhibitor组穿膜数为(18.24±7.62)个；与对照组比较，miR-374b-5p inhibitor组细胞侵袭能力降低，差异有统计学意义(P<0.05) 。见图3。

图3 干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞侵袭的影响(HE×400)

2.5干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞转移的影响 对照组细胞穿膜数为(38.94±10.35)个，miR-374b-5p inhibitor组穿膜数为(16.31±8.24)个；与对照组比较，miR-374b-5p inhibitor组细胞转移能力降低(P<0.05) 。见图4。

图4 干扰miR-374b-5p表达对乳腺癌细胞转移的影响(HE×400)

2.6miR-374b-5p对ING1的调控作用 TargetScan7.1软件在线预测显示ING1启动子区有miR-374b-5p的结合位点，可能是miR-374b-5p的靶基因。见图5A。与ING1-wt+对照共转染组相比，ING1-wt+miR-374b-5p共转染组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；ING1-mut+对照组和ING1-mut+miR-374b-5p组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5B。与对照转染组比较，miR-374b-5p mimic组细胞中ING1 mRNA表达水平下降(P<0.05)。见图5C。

图5 miR-374b-5p对ING1的靶向调控作用

A.TargetScan7.1软件预测ING1与miR-374b-5p结合位点；B.双荧光素酶报道基因试验检测miR-374b-5p靶向ING1在对照组和miR-374b-5 mimic组的表达水平；C.qRT-PCR检测ING1 mRNA在对照组和miR-374b-5 mimic组的表达水平；ING1为生长抑制因子1，ING1-wt为野生型ING1，ING1-mut为突变型ING1；与对照组比较，aP<0.05

3 讨论

乳腺癌具有高发病率、高复发率和高病死率的特点，严重威胁了女性健康[1-2]。近年来乳腺癌发病率持续增加，且该病诊断年龄具有年轻化趋势[12]。乳腺癌治疗包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等，有效地改善了患者预后，但是高复发率和高转移导致该类患者的存活率仍然很低，因此寻找乳腺癌新的治疗靶点仍是研究的热点[3-4]。研究报道，miRNAs在乳腺癌发病过程中具有重要调控作用；miRNAs虽然在多个物种中仅占基因组的1%左右，但其可调控人类基因组中超过60%的编码蛋白质基因[13]，既往研究表明，miRNAs模拟物或抑制剂可作为治疗肿瘤的药物[6-7]，miRNAs在乳腺癌中作为治疗靶点同样具有应用前景。

miR-374b-5p是新近发现的miRNAs，其异常表达与包括恶性肿瘤在内的多种人类疾病有关。Li等[8]报道，miR-374b-5p抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)，并使肿瘤细胞对顺铂治疗的敏感性增强。miR-374b-5p在胃癌细胞系中表达增加，并可促进胃癌细胞的转移、侵袭和增殖[9]。miRNAs分为促进肿瘤miRNAs和抑制肿瘤miRNAs，但是miRNAs在不同肿瘤中发挥的作用可能不同。文献报道，在三阴乳腺癌(TNBC)中高表达水平的miR-374b-5p与患者预后好相关，在TNBC细胞系中恢复miR-374b-5p的表达抑制细胞的增殖和侵袭[9-10]。Zhang等[14]采用miRCURY TM LNAq芯片技术检测出乳腺癌患者与健康对照人全血中171个差异表达的miRNAs，并用qRT-PCR验证了miR-374b-5p是乳腺癌患者全血中上调的5个miRNAs之一。本研究同样采用qRT-PCR检测，发现miR-374b-5p在乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织，提示miR-374b-5p在乳腺癌中可能为促癌miRNAs，与有关TNBC的报道[10]不一致。TNBC属于乳腺癌的一种特殊类型，其发病机制、治疗方法及预后均与普通乳腺癌不同，因此miR-374b-5p在TNBC和普通乳腺癌中发挥的作用可能不一样。文献报道，miR-374b-5p在多种肿瘤中表达异常，并具有生物学功能。本研究结果显示，miR-374b-5p在乳腺癌组织中高表达，其在乳腺癌中的功能引起本课题组的关注；为此本研究首先检测了miR-374b-5p在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937和正常乳腺细胞系MCF 10A中的表达，与正常乳腺细胞相比，其在乳腺癌细胞中的表达均显著增加，这一结果与在组织水平中的表达具有一致性。miRNAs inhibitor为有效的肿瘤治疗抑制剂，在MCF-7细胞中转染inhibitor抑制miR-374b-5p的表达后，MTS、Boyden实验和Transwell小室实验检测结果显示细胞增殖、侵袭和转移能力均降低，以上结果说明miR-374b-5p可能促进乳腺癌的发生发展。miR-374b-5p具体的调控机制需进一步研究。

研究报道，在所有miRNAs中，一半以上通过直接靶向癌基因或肿瘤抑制基因参与肿瘤的发生发展，miRNAs通过与靶基因mRNA的3′非翻译区结合，通过在转录后水平调控靶基因的表达发挥作用，其靶基因可有数十个到数百个[15]，TargetScan7.1生物信息学软件预测ING1基因3′非翻译区有miR-374b-5p的结合位点，ING1属于Ⅱ型肿瘤抑制因子的ING家族，其中ING1是最具特征的成员，编码四种蛋白异构体[15]。ING1表达缺失涉及多种人类肿瘤类型，包括胃癌、前列腺癌和肝癌等[16-19]。据报道ING家族的其他成员，特别是ING4，与乳腺癌的发生发展密切相关[20-21]。Thakur等[22]报道了ING1水平降低与乳腺癌患者转移增加相关。ING1在非小细胞肺癌细胞中作为miR-500和miR-628的直接靶基因抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和黏附，并可诱导肿瘤细胞凋亡[23]。本研究中采用双荧光素酶报告基因试验证实ING1为miR-374b-5p直接调控的靶基因，并发现miR-374b-5p mimic抑制MCF-7细胞中ING1 mRNA的表达，表明miR-374b-5p在乳腺癌中可能通过直接作用于靶基因ING1促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，但还需深入研究确认。

综上所述，miR-374b-5p在乳腺癌组织和细胞中表达相对较高，抑制miR-374b-5p的表达，降低了乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力，ING1是miR-374b-5p调控的直接靶基因。本课题组推测miR-374b-5p通过靶向抑制ING1的表达促进乳腺癌的增殖、侵袭和转移能力。miR-374b-5p可能是潜在的乳腺癌治疗靶标。