分子蒸馏纯化富含中长碳链甘油三酯的人乳替代脂

缪智诚，王雅寓，徐文迪，杨壮壮，王小三，金青哲，王兴国

(江南大学 食品学院，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

中长碳链甘油三酯(MLCT)是指甘油骨架上同时含有中链脂肪酸(MCFA)和长链脂肪酸(LCFA)的结构脂。MLCT同时含有MCFA和LCFA，一方面有利于婴儿消化吸收，另一方面可以实现脂肪酸的同步运输，使 MCFA 以一个更可控的水解速率释放到血液中，避免了酮体过量中毒，与传统的长碳链甘油三酯(LCT)、中碳链甘油三酯(MCT)相比，MLCT 在营养代谢方面存在诸多优势，有益于婴儿的生长发育[1-2]。研究发现MCFA及其单甘油酯特殊的抗菌活性对婴儿早期肠道菌群的建立有一定的影响，能够促进乳杆菌及双歧杆菌的生长，抑制变形菌的生长[3]。婴儿配方奶粉中通常以添加椰子油的形式补充MCFA，其甘油三酯结构与母乳中MLCT的结构存在较大的差异。目前，国内外虽已有大量合成MLCT的相关研究[4-5]，但是以母乳甘油三酯为模板合成MLCT人乳替代脂的报道尚少。因此，合成与母乳甘油三酯结构相似的MLCT人乳替代脂有助于婴儿配方奶粉在化学组成上更加接近母乳。

MLCT酶法酯交换合成的反应过程主要是水解反应和酯化反应[6]，因此粗产物中都会含有杂质，如游离脂肪酸、甘油二酯等，除去产物中的这些杂质可以提高MLCT结构脂的纯度，得到高质量、高附加值的产品。分子蒸馏是一种应用较广泛的物理分离纯化结构脂的方法，具有分离程度高、物料停留时间短、操作温度远低于物料在常压下的沸点、清洁环保等优点，适合分离纯化高沸点、热敏性的物质[7]。分子蒸馏的原理是根据不同分子的平均自由程不同进行分离，酯交换制备MLCT的过程中产生的游离脂肪酸、甘油二酯等副产物与甘油三酯的相对分子质量差异较大，因此可以考虑采用分子蒸馏去除。

本文采用两步酶法合成MLCT，先用棕榈硬脂与油酸、亚油酸进行酶法酸解合成富含 OPO(O为油酸，P为棕榈酸)和OPL(L为亚油酸)的结构脂，再将富含OPO和OPL的结构脂与椰子油酶法酯交换制备富含MLCT的结构脂。探讨了分子蒸馏法对分离纯化MLCT的影响，从而得到高附加值的MLCT。

1 材料与方法

1.1 实验材料

棕榈硬脂(熔点58℃)，益海嘉里有限公司；精炼椰子油，东海粮油工业(张家港)有限公司；油酸(85%)，阿拉丁有限公司；固定化脂肪酶NS40086，诺维信生物技术有限公司；猪胰脂肪酶，Sigma-Aldrich(中国)公司；薄层层析硅胶板(10 cm×20 cm)，乳山市太阳干燥剂有限公司。亚油酸(65%)、无水乙醇、无水乙醚、冰醋酸、正己烷、丙酮、甲醇、脱氧胆酸钠、氯化钙、Tris、盐酸、氢氧化钾、无水硫酸钠、酚酞、2,7-二氯荧光素、高真空硅脂，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、异丙醇、正己烷，色谱纯，百灵威科技公司。

HH-601型恒温水浴锅，金坛市精达仪器有限公司；RT 10磁力搅拌器，艾卡(广州)仪器设备有限公司； Agilent 7820A气相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；Alltech 3300蒸发光散射检测器，美国Grace公司；Waters 1525 高效液相色谱仪、2414型示差检测器、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF质谱仪(分辨率 32500(FWHM))，沃特世科技有限公司；KDL2短程分子蒸馏设备，德国UIC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高熔点棕榈硬脂的分提

参考徐文迪等[8]的方法进行棕榈硬脂的分提。

1.2.2 酶法合成富含OPO和OPL的结构脂

参考徐文迪等[8]的方法，将分提后的棕榈硬脂与油酸及亚油酸进行酶法酸解反应合成富含 OPO和 OPL的结构脂。

1.2.3 酶法合成富含MLCT的人乳替代脂

将富含OPO和OPL的结构脂与椰子油按照底物摩尔比(n(OPO+OPL)∶n(椰子油))0.8∶1混合，待反应底物完全熔化后加入底物总质量8%的固定化脂肪酶NS40086催化反应，间歇式酶反应在分批式夹套加热搅拌反应釜中进行，反应温度65℃,磁力搅拌转速350 r/min，反应时间6 h。反应结束后，离心除去脂肪酶，得到含MLCT的酯交换产物。

1.2.4 分子蒸馏纯化

采用分子蒸馏除去酯交换产物中的部分杂质，包括游离脂肪酸、甘油二酯及部分MCT。分子蒸馏条件：蒸馏温度180～230℃；压力 1 Pa；进料速度2.5 mL/min；刮板转速120 r/min；冷凝器温度30℃。

1.2.5 检测方法

1.2.5.1 总脂肪酸组成分析

脂肪酸甲酯的制备参考GB 5009.168—2016。

气相色谱条件：Agilent 7820A气相色谱仪； Trace TR-FAME色谱柱(60 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Thermo Fisher Scientific)；氢火焰离子化检测器；检测器和进样口温度250℃；升温程序为初始柱温100℃，保留1 min，随后以5℃/min的速率升温到220℃，保留15 min。通过对比混合脂肪酸甲酯标准品的保留时间对脂肪酸进行定性。

1.2.5.2 sn-2位脂肪酸组成分析

样品sn-2位单甘酯的制备按照 GB/T 24894—2010进行，再根据GB 5009.168—2016甲酯化方法处理后，将待测样过膜进行气相色谱检测，检测条件同1.2.5.1。

1.2.5.3 甘油酯组成分析

RP-HPLC-ELSD分析样品的甘油三酯组成。样品溶于色谱纯正己烷中，质量浓度为20 mg/mL，进样量10 μL。色谱条件：蒸发光散射检测器；Lichrospher C18色谱柱(250 mm×4.6 mm × 5 μm)；柱温30℃；梯度洗脱程序为0～40 min 60%乙腈+40%异丙醇，45～85 min 55%乙腈+45%异丙醇，90 min 60%乙腈+40%异丙醇；洗脱流速0.8 mL/min；雾化室温度55℃；气体流速1.8 L/min；增益1。采用峰面积归一化法定量。

NP-HPLC分析甘油酯、游离脂肪酸含量。参考Wang等[9]方法并稍作修改。样品溶解于流动相中，质量浓度为20 mg/mL，进样量20 μL。色谱条件：示差检测器；Sepax HP-Silica硅胶柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱温35℃；流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比15∶1∶0.03)，洗脱流速1 mL/min。

UPLC-Q-TOF-MS鉴定甘油三酯的构型。采用配备BEH C18柱(2.1 mm×50 mm, 1.9 μm)和四级杆飞行时间质谱仪的超高效液相色谱系统鉴定甘油三酯的构型。色谱及质谱条件参考Zhang等[10]的方法。

2 结果与讨论

2.1 分提后的棕榈硬脂及富含OPO和OPL结构脂的甘油三酯组成(见表1)

表1 分提后的棕榈硬脂及富含OPO和OPL结构脂的甘油三酯组成 %

注：P.C16∶0；S.C18∶0；O.C18∶1；L.C18∶2；ND.未检出。

由表1可知，分提后的棕榈硬脂中PPP占比高达93.54%，结构脂中OPO的含量最高，达到了39.20%，其次是OPL，含量为30.06%。

2.2 富含MLCT的酯交换产物的脂肪酸组成及甘油三酯组成

富含MLCT的酯交换产物总脂肪酸和sn-2位脂肪酸组成见表2。

表2 富含MLCT的酯交换产物的总脂肪酸和sn-2位脂肪酸组成 %

由表2可知：富含OPO和OPL的结构脂和椰子油经过酯交换得到的富含MLCT的酯交换产物同时含有中链脂肪酸和长链脂肪酸； sn-2位脂肪酸中含量最高的是棕榈酸，其次是月桂酸，这是由于两种原料油的sn-2位分别含有高含量的棕榈酸和月桂酸，在sn-1,3位特异性脂肪酶的催化作用下进行酯交换反应后，得到的产物中sn-2位仍保留高含量的棕榈酸和月桂酸。

酶法酯交换产物经过UPLC-Q-TOF-MS分析其甘油三酯组成，结果如表3所示。由表3可知，酯交换产物中有44种甘油三酯，其中含有大量的MLCT。OPLa是含量最高的MLCT，其在人乳脂中也是含量最高的MLCT。酯交换产物中其他的MLCT，如LPLa、OLaL、OLaO、OPCa、OMLa、OLaLa、LLaLa都是人乳脂中含量较高的MLCT[11]。酯交换产物中还含有一些MLCT是人乳脂中存在但含量较低的，如LLaCa、OLaCa、PMLa、LaLaM、PLaLa、OOCa、PPLa；酯交换产物中还有少量的MLCT是在人乳脂中未检测到的，主要是一些含有辛酸的MLCT，包括OCaCy、LLaCy、OLaCy、OLCy、OOCy。辛酸的相对分子质量较小，可采用分子蒸馏去除部分含有辛酸的MLCT。除MLCT之外，酯交换产物中还含有一部分未完全反应的MCT，可采用分子蒸馏除去部分。

表3 UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定酯交换产物的甘油三酯组成

续表3

注：Cy.C8∶0；Ca.C10∶0；La.C12∶0；M.C14∶0；P.C16∶0；S.C18∶0；O.C18∶1；L.C18∶2。

2.3 分子蒸馏纯化富含MLCT的人乳替代脂

2.3.1 分子蒸馏温度对重相甘油酯组成的影响

采用NP-HPLC分析重相的游离脂肪酸(FFA)、甘油二酯及甘油三酯含量，结果如表4所示。

表4 重相甘油酯组成 %

由表4可以看出，经过分子蒸馏，重相中甘油三酯含量从86.07%提高到95%以上，且甘油三酯含量随着分子蒸馏温度升高而增加。这是由于分子蒸馏温度升高，分子的平均自由程增加[12]，甘油二酯和游离脂肪酸等小分子物质更容易到达冷凝面，从而被分离到轻相中。

2.3.2 分子蒸馏温度对重相甘油三酯组成的影响

采用RP-HPLC-ELSD测定重相的甘油三酯组成，结果如图1～图3所示。

注：字母不同表示差异显著(p<0.05)，下同。

图1 分子蒸馏温度对重相甘油三酯(ECN<38)含量的影响

由图1可知，重相中相对分子质量小的甘油三酯(ECN<38)的含量随着分子蒸馏温度的升高而降低，这些甘油三酯主要是MCT。说明分子蒸馏温度越高，越来越多的MCT分子从重相逃逸到轻相中，当分子蒸馏温度达到210℃时，这部分甘油三酯的含量已降低为5.67%，当继续升高分子蒸馏温度时，变化幅度减小，没有出现显著性的差异。

图2 分子蒸馏温度对重相MLCT(ECN=38～44)含量的影响

重相中MCT含量随着分子蒸馏温度的升高而降低，理论上MLCT含量会相应增加，但是由图2可知，重相中MLCT(ECN=38～44)含量却随着分子蒸馏温度的升高先增加后降低，在分子蒸馏温度达到210℃时，MLCT含量达到最大值。这是因为随着分子蒸馏温度的升高，越来越多的MCT被蒸发到轻相中，MCT含量的减少使得重相MLCT的含量增加，当分子蒸馏温度从200℃升高到210℃时，MLCT的含量明显增加，表明结构脂中大部分的MCT都可在210℃时被分离到轻相中。然而在升温过程中，一些相对分子质量较小的MLCT也会逐渐地被分离到轻相中。当分子蒸馏温度较低时，MCT分子的逃逸占主导地位，MLCT分子不及MCT分子减少的量多，使得MLCT的含量整体仍呈现增加的趋势；当分子蒸馏温度继续升高，大部分的MCT分子已被蒸发到轻相中，越来越多的MLCT分子被蒸发到轻相中，导致重相中MLCT含量降低。

图3 分子蒸馏温度对重相甘油三酯(ECN>44)含量的影响

由图3可知，随着分子蒸馏温度的升高，重相中相对分子质量较大的甘油三酯(ECN>44)含量一直呈增加的趋势，这些甘油三酯大部分是LCT。这是由于分子蒸馏温度升高有利于小分子的MCT和MLCT逃逸到冷凝面，导致大部分的MCT及一部分相对分子质量较小的MLCT分子被回收到轻相中，LCT由于其自身的相对分子质量大，分子的平均自由程较小，在蒸发过程中无法到达冷凝面，而返回到重相中，从而使得LCT的含量随着分子蒸馏温度的升高而持续增加。

2.3.3 分子蒸馏温度对重相脂肪酸组成的影响

从前面的分析可知分子蒸馏温度会影响重相甘油三酯组成，可以推断重相脂肪酸组成也会受到相应的影响。不同分子蒸馏温度下重相脂肪酸组成如表5所示。

表5 不同分子蒸馏温度下重相脂肪酸组成

由表5可知，当分子蒸馏温度在180～230℃范围内变化时，中链脂肪酸含量随分子蒸馏温度的升高而降低，长链脂肪酸(除C14∶0)含量变化则相反。这是由于中链脂肪酸主要来源于MCT和MLCT，随着分子蒸馏温度的升高，甘油三酯中大部分的MCT和一部分MLCT被蒸发到轻相中，导致重相中的中链脂肪酸含量减少。C14∶0的含量均随着分子蒸馏温度的升高而降低的原因是由于C14∶0的相对分子质量比其他长链脂肪酸的相对分子质量小，一些含有C14∶0的甘油三酯在分子蒸馏过程中会被部分分离到轻相，如LaLaM，从而导致C14∶0的含量降低。

综上所述，最终选择210℃作为纯化MLCT的最优分子蒸馏温度，在此温度下产物中的甘油三酯含量可达到97.22%，产物中MLCT的含量最高，MCT的含量相对较低。

2.3.4 分子蒸馏纯化产物的脂肪酸组成

最优条件下分子蒸馏纯化产物的脂肪酸组成如表6所示。由表6可知，分子蒸馏纯化产物的总脂肪酸和sn-2位脂肪酸中含量最高的3种脂肪酸为棕榈酸、油酸和月桂酸。与表2对比发现，分子蒸馏后碳原子数16及以上的脂肪酸含量提高，碳原子数16以下的脂肪酸含量降低。这是由于部分MLCT经过分子蒸馏之后被除去，导致结构脂中的中链脂肪酸含量降低。C8∶0和C10∶0在母乳的总脂肪酸组成中含量很少[13-15]，通过分子蒸馏除去了产物中部分的C8∶0和C10∶0，两者的总含量从6.85%降低到3.79%。

表6 分子蒸馏后产物的脂肪酸组成 %

2.3.5 分子蒸馏纯化产物的甘油三酯组成

采用RP-HPLC-ELSD对分子蒸馏纯化产物的甘油三酯组成进行分析，结果见表7。由表7可知，酯交换产物经过分子蒸馏纯化之后，甘油三酯中的相对分子质量较小的甘油三酯含量大大降低，从14.53%下降为5.56%，而MLCT含量从67.37%增加到74.82%。

表7 RP-HPLC-ELSD测定的分子蒸馏前后产物的甘油三酯组成及含量 %

注：ECN=38～44为MLCT。

由于产物中甘油三酯的种类较多，根据RP-HPLC-ELSD的测定结果只能根据ECN值初步判定MLCT总含量的增减情况，但是具体到每一种甘油三酯的变化，还应该采用UPLC-Q-TOF-MS得到更加细致准确的结果。图4(A)和(B)分别为分子蒸馏前和分子蒸馏后的产物经UPLC测定的总离子流图。

从图4可以看出，经过分子蒸馏之后，8 min之前甘油三酯的相对含量明显降低，主要是一些相对分子量较小的中碳链甘油三酯。具体的甘油三酯组成如表8所示。对比表3可知，分子蒸馏之后， 在人乳脂中含量较高的几种MLCT[11](OPLa、LPLa、OLaL、OLaO、OMLa、LLaLa)的含量得到了不同程度的提高，其中OLaL、OMLa、LPLa、OLaO的含量变化较大。分子蒸馏之后OPLa仍是含量最高的MLCT，这与其在人乳脂MLCT中含量最高保持一致。人乳脂中含有辛酸的MLCT的含量较少，分子蒸馏之后，含有辛酸的MLCT(LCaCy、OCaCy、LLaCy、OLaCy、OLCy、OOCy)的总含量有所降低，与其他含有辛酸的MLCT的含量呈减少的变化趋势不同，OOCy和OLCy的含量有所提高，这是由于这两种MLCT分子中含有两个长链脂肪酸，比只含有一个长链脂肪酸的MLCT的相对分子质量更大，不易分离。原产物中含量较高的3种中碳链甘油三酯LaLaCy、LaLaCa及LaLaLa的含量分别从2.47%、3.31%及5.11%降低到0.23%、0.63%和2.43%。由于LCT的相对分子质量较大，需要更高的蒸馏温度才能将其从重相分离，因此在纯化过程中并不能除去LCT，但是产物中含量较高的LCT都是人乳中常见的甘油三酯，如OPO、OPL、OPM等，也属于人乳替代脂的一部分。

图4 分子蒸馏前(A)和分子蒸馏后(B)的产物的总离子流图

表8 UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定的分子蒸馏后产物的甘油三酯组成

3 结 论

本研究以酶法合成的富含MLCT的酯交换产物为原料，探究分子蒸馏温度对重相组成的影响，得到分子蒸馏的最优条件：进料温度65℃，压力1 Pa，蒸馏温度210℃，冷凝器温度30℃，刮板转速120 r/min，进料速度2.5 mL/min。经过分子蒸馏之后，产品中甘油三酯含量可达97.22%， MLCT含量得到提高。分子蒸馏纯化之后，人乳脂中含量较高的几种MLCT的含量得到了不同程度的提高，表明分子蒸馏取得了可观的成效，提高了产物中MLCT的纯度，得到了富含MCLT的人乳替代脂。