草果水提物对洛哌丁胺诱导的小鼠便秘症状的影响

杨伟倩，田 洋，张爱静，常松林，孙 娜，高晓余，范源洪

(1.云南省药食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201；2.云南省生物大数据重点实验室，云南 昆明 650201；3.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；4.云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201)

【研究意义】近年来由于人类饮食和生活方式的变化，功能性便秘愈发常见，逐渐成为降低人们生活品质的重要因素之一[1]。便秘患者表现出排便障碍，如排便时间过长、大便硬化、继发于肠道的排便疼痛，腹痛等[2-3]。目前，渗透性或分泌型泻药通常用于缓解便秘，这些疗法经常失败或仅有短期的疗效并诱导副作用[4]。因此，迫切需要一类新型的便秘无危害治疗方法。【前人研究进展】一些生物活化剂能够通过促进肠道运动来改善便秘症状且副作用较少而受到更多关注。譬如，来自浒苔的多糖被发现可以改善小鼠的便秘[5-6]，而细菌纤维素可有效缓解大鼠便秘[7]。这些研究为便秘治疗提供了一些有趣的想法和材料来源。中国药典(2010年版)记载，草果主产于云南、广西等中国西南地区，是由姜科豆蔻属植物草果(Amomumtsao-ko)的成熟果实干燥而成，具有燥湿温中、截疟除痰的功效[8]。目前，草果被证明具有一系列的生物和药理活性，如草果水提取物具有很强的抗乙型肝炎病毒效果，挥发油可增加胃粘膜血流量，血清胃泌素水平升高，抗自由基对胃黏膜损伤的活性增强[9]。有研究表明，草果具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肥胖活性[10]。草果在民间主要被用于治疗疟疾、消化不良、胃功能失调、腹痛恶心、腹泻和咽喉感染等病症[11]。且有报道称，草果单用，对于腹胀的治疗、消食化积的作用十分显著[12]。【本研究切入点】目前，尚未有关于草果水提物对功能性便秘影响的研究。【拟解决的关键问题】为明确草果水提物是否可以促进便秘小鼠肠道蠕动从而缓解便秘症状，对草果水提物润肠通便功效进行动物试验研究，以期为草果资源的开发利用和通便功效机制研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草果，产地云南。

昆明种小鼠72只，体重18～22 g，昆明医科大学提供，SPF级。

洛哌丁胺购自Sigma；麻仁丸购自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。

洛哌丁胺的配制：将20 mg洛哌丁胺溶于25 mL 0.9 %生理盐水中至终浓度为8 mg·mL-1。

麻仁丸混悬液的配制：将麻仁丸(6 g·丸-1)溶解在0.9 %生理盐水中至终浓度为60 mg·mL-1[13]。

墨汁的制备：准确称取100 g阿拉伯树胶加入800 mL水，将溶液煮沸至透明，加入50 g活性炭，将溶液煮沸3次。当溶液冷却后，用水稀释至1000 mL[14]，然后在4 ℃下储存并在使用前混匀。

1.2 方法

1.2.1 草果水提物的制备 准确称取400 g草果粉，以料液比1∶9(m∶V)加入3600 mL煮沸的超纯水于烧杯，混匀后沸水煮1 min，立即过滤。过滤后，将滤液于低速离心机连续离心3次(4500 r/min 5 min)，取上清液。将滤渣倒入煮沸的3600 mL UP水混匀后煮1 min，立即过滤。重复上述操作2次。将3次离心后的上清液进行真空冷冻干燥。

1.2.2 动物分组及给药 试验设500、750、1000 mg·kg-1·d-13个草果水提物剂量组(n=12)；同时分别设1个正常对照组、阳性对照组和便秘模型组(n=12)。样品用0.9 %生理盐水配成所需浓度。空白组灌胃0.9 %生理盐水；模型组灌胃8 mg·kg-1·d-1洛哌丁胺；阳性组灌胃900 mg·kg-1·d-1的麻仁丸混悬液；3个剂量组分别灌胃相应浓度受试物和洛哌丁胺(8 mg·kg-1·d-1)。每日经口灌胃 1 次容量均 0.2 mL·10g-1体重，连续7 d。

1.2.3 排便试验 药物干预的第6天晚上，对各组小鼠采取撤食但不撤水处理。禁食12 h后(第7天上午)，给空白组小鼠灌胃生理盐水，其他组分别灌胃洛哌丁胺和相应受试物。30 min后，灌胃墨汁并开始计时。将每只小鼠单独置于笼内，自由饮水，记录每只小鼠排出的首粒黑便时间，统计6 h内小鼠排出的粪便数量和重量[15]。观察结束后，立刻收集粪便样品并在60 ℃干燥至恒重，根据以下公式计算粪便含水率。

粪便含水率(%)= [粪便湿重(g)-粪便干重(g)]/粪便湿重(g)×100

1.2.4 小肠运动试验 药物干预的第7天晚上，同样对各组小鼠采取撤食但不撤水处理12 h。第8天上午，给空白组小鼠灌胃生理盐水，其他组分别灌胃洛哌丁胺和不同浓度的受试物。30 min后灌胃墨汁作为指示剂，20 min后，采用二氧化碳吸入法处死小鼠，随即打开腹腔，取出肠道，小心去除肠系膜，收集胃和回盲肠连接部分的小肠段，并测量其长度。测量从幽门到墨汁前沿的距离作为墨汁的推进距离，按下列公式计算墨汁推进率[16]。

墨汁推进率(%)=墨汁的推进距离/小肠的全长×100

1.3 数据分析

采用GraphPad prism 5.0软件对试验数据进行统计分析。采用独立T检验(两尾法)分析首粒黑便时间、墨汁推进率、6 h粪便重量、数量和粪便含水率等参数在空白组、给药组与模型组间的差异显著性。在小鼠便秘模型建立成功前提下，即模型组与空白组差异性显著(P<0.05)，草果水提物处理组与模型组间只要有上述1项指标差异性显著，即可认为草果水提物具有润肠通便功效[17]。

2 结果与分析

2.1 草果水提物对便秘小鼠基础机体指标的影响

草果水提物等受试物干预过程中小鼠的体重变化、饮食量和饮水量以及小鼠处死后的肝脏、盲肠脏器系数等基础指标结果如图1所示。试验期间各组小鼠体重在正常范围内浮动，摄食量、饮水量以及各脏器系数各组间亦无显著性差异(P>0.05)。说明各受试物未对小鼠的摄食、饮水等基础机体指标造成较大影响。

体重变化(A)、饮食量(B)2 d监测1次；饮水量(C)4 d监测1次，取平均值。肝脏(D)和盲肠重量(E)与体重之比在小肠运动试验后测得The body weight (A) and food intake (B) were monitored once every two days. The water consumption (C) was monitored once every four days, taking the average. The ratio of liver to body weight (D) and the ratio of cecum to body weight (E) were measured after small intestinal movement

2.2 草果水提物对便秘小鼠排便参数的影响

为确定草果水提物的通便作用，在草果水提物等受试物干预的第7天进行排便试验，观察记录每组小鼠的首粒黑便时间、粪便重量和粒数和6 h的粪便含水率。如图2所示，与空白组比较，模型组的首粒黑便平均时间从170 min延长至230 min，6 h粪便重量下降了0.3 g，粪便粒数减少8粒，6 h粪便含水率下降了20 %，差异性均达极显著水平(P<0.01)，表明小鼠便秘模型建立成功。

干预的第7天通过观察、分析获得小鼠首粒黑便时间(A)，6 h粪便重量(B)，粪便粒数(C)和粪便含水率(B)。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001On the seventh day, recorded the first black fecal time (A), the fecal pellet number (B), the fecal weight (C) and the fecal water content (D) in 6 hours. Compared with the control,*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001

与模型组相比，草果水提物高剂量组小鼠的首粒黑便时间减短至180 min，差异性显著(P<0.05)；6 h粪便重量增加0.2 g，粪便粒数增加5粒，粪便含水率增加15 %，差异性均达极显著水平(P<0.01)。同时，中剂量草果水提物亦显著增加了小鼠6 h排便重量、粒数和粪便含水率。表明，中高剂量的草果水提物均可显著改善小鼠的便秘症状，高剂量改善效果更好。

2.3 草果水提物对便秘小鼠小肠蠕动的影响

肠道内容物在小肠内的蠕动速度即胃肠道的转运率是评价受试物润肠通便效果的重要指标之一。小肠运动试验中所得小肠长度以及墨汁推进率用于判断草果水提物对便秘小鼠胃肠道转运率的影响。由图3-A可知，各组小鼠小肠长度差异性不显著(P>0.05)；因此，可排除其对小肠运动试验结果的影响。模型组的墨汁推进率比空白组显著减少40 %，两组间差异性极显著(P<0.001)，表明便秘模型成立。草果水提物中、高剂量组小鼠的墨汁推进率与模型组相比显著增加20 %(P<0.05)、40 %(P<0.001)，表明草果水提物可以通过促进便秘小鼠小肠蠕动从而缓解便秘。

干预的第8天，经墨汁灌胃20 min后，小鼠小肠长度(A)和胃肠道转运率(B)。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001On the eighth day, small intestine length (A), and gastrointestinal transit ratio(B) were observed in 20 min later after gavaging black ink of constipated mice. Compared with the control,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001. Compared with the model group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 讨 论

天然植物和产品因其有效性和相对安全性而作为治疗便秘的候选成分而备受关注[18]。草果是一种具有特殊风味的药食同源植物。但目前，中国超90 %的草果都作为辅料添加到食品中，在其他研究领域以及药品配制中的应用不足10 %[19]。草果含有丰富的营养成分，如糖类、膳食纤维、蛋白质、氨基酸、油脂、花青素等[20]。膳食纤维，被人体消化酶显示不易消化，并经结肠细菌菌群消化，产生各种终产品，包括短链脂肪酸(主要为乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐)、气体(氢气，甲烷，二氧化碳)以及维持细菌生长的能量[21]。其中，短链脂肪酸已被证明可以促进结肠蠕动[22]。不溶性纤维在增加粪便重量和持水力方面特别有效。草果是具有抗氧化和抗炎活性的生物活性成分的有效来源[23]。这些证据证明，草果具有缓解便秘的物质基础，但其作用效果及潜在的作用机制尚不清楚。研究草果水提物对便秘症状的改善作用，是首次作为具有生物活性的植物源来探究其对便秘的改善作用。

便秘是一种常见的肠道问题，其主要临床症状包括排便困难、排便次数减少、大便干燥和坚硬[24]。研究中使用首粒黑便时间、6 h粪便含水率、粪便重量、数量和墨汁推进率评价草果水提物对便秘小鼠症状的改善作用。胃肠内容物的蠕动主要通过测量墨汁推进率来检测。研究表明，草果水提物可以通过促进小肠蠕动来缓解便秘。粪便和排便特征可以直接反映便秘，因为粪便在肠道中的保留时间长且水的过度吸收可导致粪便干硬，增加排便困难。本研究中，首粒黑便时间和6 h粪便含水率、粪便重量和数量提供了草果水提物改善便秘症状的直接证据，即草果水提物可以通过缩短首粒黑便时间和增加粪便含水量、数量和重量来缓解便秘。

本试验秉承实验动物的“3R”原则，即1959年动物学家Russell和微生物学家Burch提出的Reduction (减少)、Replacement (替代) 和Refinement (优化)[25]，在确保实验结果不受影响的前提下，尽量减少实验动物的数量以减轻其痛苦[26]。在前期试验基础上，选用72只昆明种小鼠受试8 d，在第7和8天连续开展排便试验和小肠运动试验，与模型对照组相比，中、高剂量草果水提物可以显著提高便秘小鼠的胃肠道转运率，缩短首粒黑便时间，增加6 h排便数量、重量及其粪便含水率。因此，可以认为草果水提物可显著改善洛哌丁胺诱导的小鼠便秘症状，具有润肠通便的功效。

渗透性和容积性的泻药是目前用于便秘治疗的主要药物，这些药物在减轻部分患者便秘症状的同时会产生一些副作用，甚至会形成药物依赖从而对健康造成威胁。试验过程中，低、中、高剂量草果水提物(500、750、1000 mg·kg-1·d-1)均没有引起小鼠体重、摄食等机体指标的异常变化，亦没有出现腹泻、精神状态不佳等明显副作用症状，表明草果水提物的润肠通便作用温和。麻仁丸是具有润肠通便功效的复方制剂，由麻子仁、杏仁、大黄、厚朴、枳实及芍药等中药组成[27-28]，是一种成熟的治疗便秘的中药。本试验结果表明，高剂量的草果水提物干预后，便秘小鼠的排便参数和小肠运动结果都与阳性药物麻仁丸非常接近。这些证据证明，草果水提物可以温和地改善便秘，但对草果水提物改善便秘症状的有效成分和作用机制尚不清楚。

4 结 论

通过小鼠排便和小肠运动试验研究发现，与洛哌丁胺诱导的便秘模型小鼠相比，中、高剂量草果水提物(750、1000 mg·kg-1·d-1)干预组的小鼠胃肠道转运率得到显著提高，首粒黑便时间显著地缩短，6 h粪便含水率、粪便数量和重量显著增加。据此，草果水提物可显著改善洛哌丁胺诱导的小鼠便秘症状，具有可靠、温和的润肠通便功效。本研究首次报道了草果水提物可以通过促进小肠蠕动来温和有效的缓解便秘症状。