茶树叶片响应茶饼病侵染的转录组分析

孙云南，许燕，冉隆珣，蒋会兵，宋维希，夏丽飞，陈林波，梁名志

茶树叶片响应茶饼病侵染的转录组分析

孙云南，许燕*，冉隆珣，蒋会兵，宋维希，夏丽飞，陈林波，梁名志*

云南省农业科学院茶叶研究所/云南省茶树种质资源创新与配套栽培技术工程研究中心/云南省茶学重点实验室，云南 勐海 666201

采用高通量测序技术对被茶饼病病菌侵染的茶树叶片进行转录组测序，筛选得到差异基因359个，其中248个上调表达，111个下调表达。差异基因中有216个获得GO（Gene ontology）数据库功能注释，主要涉及到生物合成过程、催化活性、细胞过程等诸多生理生化过程；KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库富集分析发现，共有106个基因被注释到47个代谢通路中，其中，单萜生物合成、卟啉和叶绿素代谢、核糖体、氮代谢、双萜生物合成、植物病原互作等通路显著富集。有32个差异基因被鉴定为转录因子，分布在16个转录因子家族中。利用实时荧光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）验证了随机挑选的差异基因在感病叶片和未感病叶片中的相对表达量，与转录组测序结果的变化趋势一致。结果表明，茶树响应病原菌侵染是一个复杂的过程，大量基因被诱导或抑制表达，与抗病相关的转录因子被大量激活且上调表达。本研究为深入挖掘茶树抗病基因及进一步研究抗病分子机制提供了理论依据。

茶树；茶饼病；转录组；差异基因

茶叶生产在我国农业经济、农村发展和社会主义新农村建设方面占有举足轻重的地位，是农业增效、农民增收的重要产业。然而茶树病害一直是我国茶叶高产、优质和高效生产的重要限制因子之一[1-2]。同时，随着欧盟对茶叶进口农残检测标准的一再提高，茶树病害及其防治过程中的农残问题也成为限制我国茶叶产品出口的重要因素[3]。因此，开展茶树对病害防御机制和新型内源相关抗病基因筛选的研究已成为解决这一问题的关键。

茶饼病病害在中国所有茶区几乎都有分布，尤其是在中国西南山区茶园中发生极为严重[2]。茶饼病病原菌为，属担子菌亚门，外担菌目，外担菌属真菌，属于活体营养真菌。主要危害嫩叶、新梢，是茶树上一种主要芽叶病害，不仅影响产量，而且用感病芽叶生产的毛茶易碎且味苦，茶叶品质下降明显，影响经济效益[4-7]。近年来，转录组测序技术（RNA-seq）被广泛应用于植物与病原菌互作机理研究，在水稻[8]、拟南芥[9]、番茄[10]、棉花[11]、苹果[12]、葡萄[13]、玉米[14]、板栗[15]和烟草[16]等多种植物中都有应用，筛选出了大量与抗病相关的基因及代谢通路，为深入研究植物和病原菌互作分子机制和植物抗病机理提供了重要信息。王玉春[17]利用RNA-seq技术，以抗病品种中茶108和龙井43为试验材料，进行炭疽菌感染，结果表明茶树抗炭疽病与茶树植物激素和咖啡碱的合成代谢相关。

目前，对茶饼病的研究主要集中在发生危害规律、抗病品种选育，以及防控药剂的筛选上[4,18-22]，在转录组水平上研究茶树响应茶饼病病原菌侵染的关键基因表达研究仍鲜见报道。本研究利用Illumina HiSeq高通量测序技术对感病和未感病茶树叶片的转录组进行研究，结合生物信息学分析方法对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析，基于转录组水平研究茶树响应茶饼病病原菌侵染关键基因的表达，挖掘与抗病相关的基因，为茶树抗病相关基因的克隆和功能验证以及茶树抗病机理等研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以云南省农业科学院茶叶研究所科研试验基地内种植的无性系良种76-38（由云南省农科院茶叶研究所以南糯大叶茶群体后代为原始材料，经系统选育获得）为材料，测序样品来自田间管理方式完全相同的同一地块，根据叶片的感病状况，试验材料分为感病组YCCB（感病初期茶树叶片）和对照组YCCK（健康的茶树叶片）（图1）。感病组取受茶饼病感染，病斑刚好发白直径为0.3~0.5 cm且无其他病斑、虫眼的茶树叶片，去除病斑，液氮速冻；对照组取与感病叶同等嫩度的无病斑、无虫眼的健康叶片，并去除与感病叶病斑同等大小叶面积的叶片，液氮速冻。转录组测序分析由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.2 样品RNA的提取与检测

使用Trizol法提取样品的总RNA，采用1%的琼脂糖凝胶电泳、NanoPhotometer®spectrophotometer（IMPLEN，CA，USA）、Qubit®2.0 Flurometer（Life Technologies，CA，USA）、Agilent Bioanalyzer 2100 system（Agilent Technologies，CA，USA）对提取到的RNA进行纯度、浓度和完整性的检测。

1.3 文库的构建和测序

检测合格的RNA样品，用Oligo（dT）富集mRNA，使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒将mRNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增，再用Blue Pippin进行片段筛选，对全长cDNA进行损伤修复、末端修复、连接测序接头得到最终的文库。构建好的文库采用Qubit 2.0、Agilent 2100进行检测。库检合格后，使用高通量测序平台Illumina HiSeq2500测序。

图1 健康叶片和感病叶片

1.4 转录本拼接与基因的功能注释

由于试验开始时茶树基因组测序未完成，所以按无参考基因组的样本进行组装分析。测序得到的原始序列经过滤后，得到clean reads，采用Trinity软件对clean reads进行拼接，挑选最长的转录本作为Unigene（Universal gene），使用Nr（NCBI non-redundant protein sequences）、Nt（NCBI nucleotide sequences）、Pfam（Protein family）、KOG/COG（euKaryotic ortholog groups/Clusters of orthologous groups of proteins）、Swiss-prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database），KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）、GO（Gene ontology）等七大数据库对Unigene进行基因功能注释。植物转录因子预测使用iTAK软件，其原理是利用数据库中分类定义好的TF（Transcription factor）家族及规则，通过hmmscan鉴定TF。

1.5 差异表达基因的筛选与分析

以Trinity拼接获得的转录组为参考序列，把样品的clean reads与参考序列进行比对，采用RSEM软件统计每个样品比对到每个基因上的数目，通过TMM（Trimmed mean of M-values）对统计到的数据进行标准化，然后用DEGseq（DEGseq is an R package to identify differentially expressed genes from RNA-Seq data）进行差异分析，以差异显著性qvalue<0.005且表达差异倍数|log2Fold change|>1（Fold change=YCCB/YCCK）为条件来筛选差异基因，当某个基因的qvalue<0.005且log2Fold_change>1，则该基因为有显著性差异的上调表达基因；反之，若qvalue<0.005且log2Fold_change<–1，则认为该基因为有显著性差异的下调表达基因。采用KEGG代谢通路富集分析和GO功能富集分析方法对筛选得到的差异表达基因进行富集分析。

1.6 实时荧光定量PCR验证

2 试验结果

2.1 测序数据质量分析

利用Illumina HiSeq 2500测序平台分别对感茶饼病叶片（YCCB）和对照叶片（YCCK）进行转录组测序。测序得到的原始序列经去除接头、未知序列比例大于10%的reads和低质量reads后，在YCCK中获得64 006 918条clean reads，在YCCB中获得45 114 082条clean reads。测序结果显示，感病叶片和对照叶片GC含量均大于44%，Q20、Q30值都高于91%（表2），表明转录组测序的质量较高，可以进行下一步分析。采用Trinity对clean reads进行拼接，得到271 523条转录本序列，挑选最长的转录本作为Unigene，共获得174 809条，其平均长度为1 138 bp，N50为1 622 bp，说明拼接效果良好。

表1 实时荧光定量PCR的基因及引物

表2 转录组测序数据一览表

2.2 基因表达水平分析

采用RSEM软件，以Trinity拼接获得的转录组为参考序列，把样品的clean reads与参考序列进行比对，统计每个样品比对到每个基因上的数目，并对其做FPKM（Expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）转换，用于分析基因的表达水平。结果显示，感病叶片有33 205 924条序列定位到参考序列，占clean reads的78.39%。对照叶片有47 425 126条序列定位到参考序列，占clean reads的78.70%。对不同试验条件下基因的FPKM做密度分布图及盒形图（图2），在整体水平上检查不同试验条件下FPKM分布的情况，从FPKM密度分布发现，感茶饼病叶片和对照叶片的基因总体表达量在离散度和总体分布度上存在一定差异，表明茶树在茶饼病侵染后，部分基因的表达发生了改变。

2.3 差异表达基因的筛选

利用差异显著性（qvalue）结合差异表达倍数（Fold change=YCCB/YCCK）来控制假阳性率，以qvalue<0.005且|log2(Fold change)|>1为阈值来筛选差异基因，统计分析所得的差异基因个数，共获得差异基因359个，其中上调表达248个，下调表达有111个（图3）。说明茶树在茶饼病危害后，茶树的自我防御机制被启动，通过对自身基因表达的改变来防御茶饼病对茶树的危害。

2.4 差异表达基因的GO功能富集分析

对筛选出的差异基因进行GO功能富集分析，寻找茶树叶片在受到茶饼病病菌感染后表达变化显著的差异基因的主要功能，结果如图4所示。

359个差异基因中有216个获得功能注释，对127个上调的差异表达基因富集结果进行分析，生物过程共富集到690个GO条目，其中显著富集的有23个GO条目，富集差异基因数最多的是细胞成分组成或生物起源（Cellular component organization or biogenesis）。细胞组分共富集到159个GO条目，其中显著富集的有5个GO条目，富集差异基因数最多的是细胞质（Cytoplasm）。分子功能共富集到232个GO条目，其中显著富集的有15个GO条目，富集差异基因数最多的是碳氧裂合酶活性（Carbon-oxygen lyase activity）。进一步通过topGO有向无环图分析富集程度发现，生物过程中倍半萜烯合成酶活性（Sesquiterpene synthase activity）富集程度最高，分子功能中倍半萜烯生物合成过程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）富集程度最高，细胞组分中细胞壁（Cell wall）富集程度最高。

图2 基因表达水平比对

注：散点代表各个基因，蓝色圆点表示无显著性差异的基因，红色圆点表示显著上调的差异基因，绿色圆点表示显著下调的差异基因

下调的89个差异表达基因中，生物过程共富集到549个GO条目，其中显著富集的有酰胺生物合成过程（Amide biosynthetic process）和应激反应（SOS response）。细胞组分共富集到182个GO条目，其中显著富集的有细胞壁（Cell wall）和细胞质（Cytoplasm）。分子功能共富集到281个GO条目，其中显著富集的有胞嘧啶核苷酸激酶活性（Cytidylate kinase activity）、四氢叶酸脱氢酶活性[Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (NADP+) activity]、RNA解旋酶活性（RNA helicase activity）和核苷酸激酶活性（Nucleotide kinase activity）4个GO条目。

2.5 差异表达基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析结果显示（图5），共有106个差异表达基因被注释到了47个通路中，其中显著富集通路（＜0.05）有6个，主要参与到单萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）、卟啉和叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）、核糖体（Ribosome）、氮代谢（Nitrogen metabolism）、双萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）。单萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）注释到6个差异表达基因（1个下调，5个上调）、卟啉和叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）注释到5个差异表达基因（3个下调，2个上调）、核糖体（Ribosome）注释到9个差异表达基因（8个下调，1个上调）、氮代谢（Nitrogen metabolism）注释到3个差异表达基因（1个下调，2个上调）、双萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）注释到2个差异表达基因（2个均为上调）、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）注释到7个差异表达基因（4个下调，3个上调）。

图4 差异基因的GO富集分析

图5 差异基因的KEGG显著富集分析

2.6 差异基因的转录因子分类

359个差异基因中有32个与转录因子相关，其中有23个上调表达，9个下调表达。如表3所示，AP2-EREBP转录因子基因家族有6个差异基因，全部为上调基因，丰度最高；其次为HMG、FHA、MYB转录因子基因家族，各有3个差异基因；C2H2、C3H、WRKY、PHD家族各有2个差异基因；zf-HD、HB、GRAS、SNF2、TUB、bHLH、G2-like、Sigma70-like家族也有差异基因被注释。32个转录因子相关基因分布到了16个转录因子家族中，且大量分布在与植物抗生物胁迫相关的转录因子家族中。

2.7 差异表达基因的qRT-PCR分析

以茶树的GAPDH（AB120309.1）基因为内参基因，随机选取6个差异表达基因（Cluster-1911.66155、Cluster-1911.67296、Cluster-1911.44247、Cluster-1911.78592、Cluster-1911.61836和Cluster-1911.66418）进行qRT-PCR验证。从图6可以看出，6个差异表达基因在感染茶饼病叶片和未感染茶饼病叶片的相对表达量与转录组差异分析的变化趋势是一致的，从而说明转录组测序分析结果是可靠的。

3 讨论

植物响应病原体入侵时激活的免疫机制十分复杂，茶树品种76-38在受到茶饼病病菌侵染后，病原菌诱导或抑制茶树大量基因的表达变化。

植物通过进化形成多种防御机制来抵御病虫害入侵。一种是物理防御机制，有研究认为植物抵御大多数病原菌侵染的第一道屏障是细胞壁，当病原菌入侵时，植物通过合成木质素聚合物、沉积胼胝质、积累酚类化合物等，使病原菌入侵点的细胞壁强度增强来抵御病虫害入侵[23-26]；另一种为化学防御机制，即利用生物活性分子物质防御，植物通过合成和积累生物活性分子物质包括皂苷、咖啡因、水杨酸甲酯、植保素（Phytoalexin）等[27]抑制或杀灭病原菌。植保素的种类繁多，现已有200多种被发现并鉴别，其中研究最深入的是类黄酮和萜类[28]。本研究GO富集分析发现，上调的差异基因富集程度最高的是倍半萜烯生物合成过程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）、倍半萜烯合成酶活性（Sesquiterpene synthase activity）和细胞壁（Cell wall）。KEGG代谢通路富集显示单萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）和双萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）代谢通路显著富集，说明茶树在受到茶饼病病原菌侵染后，物理防御被激活，与细胞壁相关的差异基因大量上调表达，以增强细胞壁强度抵御茶饼病病原菌的入侵，同时化学防御机制被激活，产生大量的萜烯类生物活性分子抑菌物质，抑制病菌繁殖，阻止病原菌进一步扩散。

表3 差异基因中转录因子

注：“*”代表基因在YCCB和YCCK之间的表达差异显著性，*：P<0.05，**：P<0.01

Ca2+是细胞的第二信使，当病原菌侵染后细胞内产生的钙信号参与调节介导植物抗病基因的表达[29]。在植物中，环腺苷酸门通道（CNGCs）参与K+、Na+和Ca2+等阳离子的非选择性吸收和转运，Dodd等[30]发现拟南芥CNGCs基因调节Ca2+浓度参与对病原微生物的响应。钙调蛋白（CaM）是一类钙离子结合蛋白，是最重要的Ca2+受体，在植物的生长发育和抗逆抗病过程中起重要的调控作用。Yamakawa等[31]研究发现，烟草在受到烟草花叶病毒侵染后，烟草中钙调蛋白基因的表达上调。钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是在植物及原生动物中发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与多种Ca2+介导的信号通路，在Ca2+介导的发育信号和逆境信号转导中具有重要作用，Lu等[32]对拟南芥的CPK基因进行沉默后，发现细菌激发子flg22介导的活性氧损伤和病原菌的防御反应被AtCPK4、CPK5、CPK6和CPK11共同调控。本研究发现，茶树响应茶饼病病原菌侵染的过程中KEGG代谢通路富集显示，在植物病原互作代谢通路中与Ca2+相关的CNGCs、CDPK、CaM等基因的表达量变化显著，这与前人的研究结果一致。

Seifi等[33]提出，在植物与病原菌互作中，谷氨酸代谢与植物的防御策略密切相关。Kadotani等[34]的研究首次发现水稻根部用外源谷氨酸处理后，可提高植株对稻癌病的抗性。杨佳丽[35]研究发现L-谷氨酸不论是采前喷洒还是采后处理的方式均可有效提高果实对采后病原菌的抵御能力。本研究发现氮代谢通路显著富集，其中谷氨酸合成酶显著上调表达，谷氨酸是否也参与了茶树对抗病原菌还有待进一步的研究。

相关研究显示，当植物受到病原菌侵染时，在植物与病原菌互作的过程中转录因子介导转录调节。目前，C2H2、AP2-ERF、WRKY和MYB等与植物抗病相关的转录因子已有较多报道，何兰兰等[36]发现，棉花在受到枯萎病菌诱导后，AP2-EREBP亚族转录因子基因表达量明显增加，并且抗病品种显著高于感病品种。Zhao等[37]研究发现拟南芥AP2-EREBP转录因子基因对植物抗灰霉病具有正向调节功能。MYB转录因子在植物与病原菌互作过程中是正调控因子，能够通过调控细胞程序性死亡或激活植物的防御反应来增强植物抵抗病原菌的能力[38]。McHale等[39]发现，烟草的MYB家族基因参与茉莉酸调控的防御反应，通过间接调控下游基因的沉默和过量表达来减轻病害威胁。Tian等[40]发现马铃薯C2H2锌指蛋白基因在受到致病疫霉感染后其表达量增加。Zhang等[41]发现烟草C2H2锌指蛋白基因被沉默时核盘菌SScut蛋白诱导的烟草免疫反应被抑制。AbuQamar等[42]在拟南芥中发现5个C3H型锌指蛋白，其中发生突变后，对灰葡萄孢菌的敏感性增加。Guo等[43]从盐胁迫诱导的棉花植株中克隆出来一个C3H转录因子基因，当基因在烟草中过量表达时，烟草对盐胁迫的耐受力增强，而且对病原菌R.solani产生了较高的抗性。Mayrose等[44]发现细菌病害侵染番茄时，GRAS转录因子家族中有6条基因上调表达，当沉默基因时，番茄对细菌病害的抵抗能力降低。上述研究表明转录因子在植物抗病过程中的重要性，与本研究中茶树在被茶饼病病原菌侵染后AP2-EREBP、MYB、C2H2、C3H、GRAS、bHLH家族转录因子全部上调表达的结果互相印证。

本研究通过对感染茶饼病的茶树叶片和未感病茶树叶片的转录组表达情况进行分析，筛选出差异表达基因359条，其中有248条上调表达，111条下调表达。差异基因的GO功能富集分析显示，生物学过程中倍半萜烯生物合成过程（Sesquiterpenoid biosynthetic process）条目、细胞组分中细胞壁（Cell wall）条目、分子功能中倍半萜烯合成酶活性（Esquiterpene synthase activity）条目的富集程度最高；KEGG富集分析显示，单萜生物合成（Monoterpenoid biosynthesis）通路、卟啉和叶绿素代谢（Porphyrin and chlorophyll metabolism）通路、核糖体（Ribosome）通路、氮代谢（Nitrogen metabolism）通路、双萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）通路、植物病原互作（Plant-pathogen interaction）通路被显著性富集。这些显著性富集的功能和代谢通路大多数与植物抗病相关，并且上调的差异表达基因明显多于下调，同时，茶树在响应茶饼病侵染后，激活了AP2-EREBP、MYB、C2H2、C3H、GRAS、bHLH等大量与抗病相关的转录因子高表达。本研究为挖掘茶树抗病基因、进一步研究茶树抗病分子机制以及茶树对茶饼病抗性育种提供了丰富的信息和重要的理论依据。

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Transcriptome Analysis of the Tea Leaves (var.) Infected by Tea Blister Blight

SUN Yunnan, XU Yan*, RAN Longxun, JIANG Huibing, SONG Weixi, XIA Lifei, CHEN Linbo, LIANG Mingzhi*

Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Matching Cultivation/Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China

IlluminaHiSeq2500, a high-through transcriptome sequencing technology, was applied for transcriptome analysis of tea leaves infected by tea blister blight. Through differential expression analysis, a total of 359 differentially expressed genes (DEGs）were identified after infection, of which 248 were up-regulated and 111 were down-regulated. With GO function annotation classifications, a total of 216 genes were divided into 122 function categories. The mainly involved functional categories included biological synthesis process, catalytic activity, cell process and many other physiological and biochemical processes.KEGG enrichment analysis showed that a total of 106 genes were annotated to 47 metabolic pathways, with monoterpenoid biosynthesis, porphyrin and chlorophyll metabolism, ribosome, nitrogen metabolism, diterpenoid biosynthesis, plant-pathogen interaction pathway significantly enriched. There were 32 differentially expressed transcription factors(TFs). Those TFs were classified into 16 families.qRT-PCR of randomly selected differentially expressed genes was used to validate transcriptome result, which showed high consistence.The result shows that tea tree response to pathogen infection is a complicated process. A number of genes were induced or suppressed. Disease-resistant transcription factors were highly activated and up-regulated.This study provided a theoretical basis for identifying tea resistance genes and potential molecular mechanism.

, tea blister blight,transcriptomics, different expression genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2020)01-113-12

2019-04-02

2019-06-18

国家自然科学基金项目（31660224）、国家重点研发项目（2016YFD0200903）、国家茶叶产业技术体系（CARS-19）、云南省人才培养计划项目（2015HB105）

孙云南，男，助理研究员，主要从事茶树生理生化方面的研究，sunyn2013@126.com。

liangmingzhi@126.com