白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

周喆，陈志丹，吴全金，徐一岚，孙威江1,*

白鸡冠茶树基因全长cDNA克隆与表达分析

周喆1,2,4，陈志丹2,3,4，吴全金5，徐一岚3，孙威江1,2,3,4*

1. 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2. 安溪县现代农业产业协同创新中心，福建 泉州 362400；3. 福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400；4. 福建省茶叶工程技术研究中心，福建 福州 350002；5. 福建广播电视大学财经与管理系，福建 福州 350002

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase，PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶，它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a，脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物，被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料，克隆获得基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094），并对其进行生物信息学分析。结果表明，全长为1 298 bp，包含的ORF序列为1 241 bp，编码413个氨基酸。序列分析表明，该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白，其预测分子量为45 741.50 Da，理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示，遮荫抑制白鸡冠叶片的表达，叶绿素升高，叶色变绿；光照促进白鸡冠叶片的表达，叶绿素降解，导致叶片白化。

茶树白化；基因；克隆；生物信息学分析

近年来，我国茶树品种和茶叶品类呈“五颜六色”发展趋势[1]。白鸡冠是武夷山“四大名丛”之一，自发现并被利用至今已有三百余年的历史[2]。王开荣等[3]研究提出，光照敏感型白化茶的白化—返绿共性取决于光照强度，随光照强度增强白化明显，而与温度、土质、肥培条件基本无关。Wu等[4]研究表明，白鸡冠茶树属于光照敏感型茶树。目前，茶树白化叶片产生的原因有很多，主要聚焦于叶绿素合成途径和类胡萝卜素途径。前人研究认为，由于白化茶树叶绿素合成少于常规绿叶品种，导致新梢白化[5-7]。类胡萝卜素生物合成被抑制也会导致茶树在强光或正常光照下产生光氧化损伤，从而对叶绿体发育造成影响[5,8]，形成白化表型。但也有研究报道指出，其可能是叶绿素的降解速率大于合成速率，导致叶色白化[9]。

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase，PPH）是叶绿素降解代谢中的关键酶。自2009年发现了基因后，叶绿素降解途径的研究又进一步更新[10-11]。叶绿素降解主要有两条途径：一是叶绿素a被叶绿素酶（Chlorophyllase，CLH）脱去植醇（Phytol），形成脱植基叶绿素a（Chlorophyllide a），之后在脱镁酶（SGR）的作用下脱去镁离子，形成脱镁叶绿酸a（Pheophorbide a），又在脱镁叶绿素加氧酶（Pheophorbide a oxygenase，PAO）作用下形成红色叶绿素代谢副产物（Red chlorophyll catabolite，RCC），然后被RCC还原酶（Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）还原成初级荧光叶绿素分解代谢产物（Primary fluorescent chlorophyll catabolite，PFCC）；二是叶绿素a先被脱镁酶脱去镁离子，形成脱镁叶绿素a（Pheophytin a）后被基因催化脱去植醇，形成脱镁叶绿酸a，此后降解与第一条途径一样，最终降解成初级荧光叶绿素分解代谢产物（PFCC）[12-14]。基因位于叶绿素降解途径2，能够专一脱去植醇，形成脱镁叶绿酸a。许多研究者克隆了不同植物中的基因，发现可能会促进植物衰老[15-17]。叶绿素的合成与降解是由多组酶参与的过程，其中任何一个编码酶基因的突变都有可能使相关酶的活力发生改变，影响相关物质的合成，从而导致叶绿素降解过程受阻，使叶色表现出不同程度的变化[18]。在常规绿叶植物中，它的缺失会使植物呈现滞绿表现型，导致叶绿素降解过程减缓[15]。基因在水稻[19]、甘蓝[20]、黄瓜[15,21]、小麦[22]、凤梨[23]、芥蓝[24]、花椰菜[25-26]等植物中相继被克隆，但是前人对植物基因的研究多集中于其造成的植物衰老滞绿方面[15]，关于基因在白化茶树中的作用机制，目前鲜有研究。

白鸡冠与常规绿色茶树品种相比，其关键化学成分和转录模式都有很大不同。研究其叶绿素代谢过程中的分子机制，有助于了解白化茶树体内的代谢变化及遗传变异，对研究茶树光合作用机制、叶色调控机理、叶片发育调控等有重要理论价值[27]，同时也在茶树生长发育、抗逆性、良种繁育等方面具有重要的应用价值[28-29]。因此本研究主要以白鸡冠茶树为研究对象，克隆了基因的cDNA全长序列，并对其进行了生物学信息分析和表达分析，初步研究不同遮荫处理下基因的表达差异导致叶绿素降解差异对白鸡冠茶树叶片白化的影响，为深入研究白鸡冠茶树的白化机制提供分子方面的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验材料为白鸡冠茶树叶片，取自武夷星茶业有限公司种质资源圃（北纬27°55′15″，东经118°02′50″）。2018年9月中旬，用铝箔进行第二叶位叶片的遮荫处理，遮荫处理方法如表1所示。试验记录频率为24 h一次，达到对应遮荫天数时取下铝箔，观察白鸡冠茶树叶色的恢复情况。取样时，遮荫前、遮荫复绿及复绿重新光照叶片作为一组。取生长发育状况相近，形状大小一致的第二叶位叶片，迅速用液氮冷冻处理，置–80℃冰箱保存，用于基因克隆和qRT-PCR检测。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片叶绿素含量的检测

根据遮荫处理组，使用SPAD502叶绿素含量测定仪（Konica Minolta）对白鸡冠第二叶位叶片进行检测，主脉两侧各随机选取3个点进行测定，取平均值。采用Excel 2010和SPSS 22.0进行误差检验和单因素方差分析（ANOVA）。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成

采用天根的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）提取白鸡冠第二叶的总RNA；用超微量分光光度计（赛默飞，Nano Drop 2000c）测定提取的总RNA浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测所得的总RNA的完整性，于–80℃冰箱保存备用。

采用Promega goscriptTMreverse transcription system（A5000，PROMEGA，USA），按说明书步骤进行cDNA反转录，用于后续的RT-PCR和qRT-PCR试验。

1.2.3基因的全长cDNA克隆

从NCBI搜索拟南芥的PPH蛋白序列并下载，将其在茶树基因组数据库中进行比对得到候选基因的蛋白序列，根据得到的蛋白序列编号检索茶树的cDNA序列并下载，最后筛选得到茶树基因。利用DNAMAN设计引物（表2）。在其编码区的两端设计引物-F和-R，以白鸡冠茶树第二叶cDNA为模板，使用高保真酶TaKaRa Prime STAR GXL DNA Polymerase：R050A进行PCR扩增，扩增体系为：5×Prime STAR GXL Buffer 10 µL，dNTP Mixture 4 µL，上下游引物、cDNA模板、Prime STAR GXL DNA Polymerase各1 µL，用ddH2O补至50 µL。PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；98℃变性10 s，56℃退火15 s，68℃反应64 s，共34次循环；72℃延伸5 min。使用1%的琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带，验证后切胶，使用Omega胶回收试剂盒（Gel extraction kit）进行胶回收。胶回收产物连接到pESI-Blunt simple vetor（30 g·µL-1）载体，转入DH5α感受态细胞，培养16~18 h后挑取克隆摇菌，菌液经PCR验证后挑选5个阳性克隆送至福州铂尚测序公司测序。

1.2.4基因的生物学信息分析

通过NCBI的Blast功能进行氨基酸序列同源性比较；通过ProtParam在线网站（http://web.expasy.org/protparam）预测编码蛋白的理化性质和蛋白质的一级结构；通过ProtScale（https://web.expasy.org/ protscale）对蛋白质亲疏水性分析；通过TMHMM和TMpred（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM）进行蛋白质跨膜结构的预测；SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/ SignalP）进行编码氨基酸的信号肽预测；采用SMART软件对编码蛋白结构域进行预测，运用Scratch Protein Prodictor和Phyre2对蛋白质序列进行二、三级结构预测。通过NCBI-CDD分析保守结构域。通过TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）预测茶树基因的亚细胞定位；运用MEGA 7.0软件中的近邻相接法（Neighbor-Joining，NJ）（500 Bootstrap Method）构建基因同源进化树。

1.2.5基因的实时荧光定量PCR分析

表2 引物序列

2 结果与分析

2.1 CsPPH基因的cDNA全长克隆

经克隆得到基因的cDNA全长序列为1 298 bp。经开放阅读框（ORF）软件分析，基因含有1 241 bp的完整ORF，编码413个氨基酸（图1）。经琼脂糖凝胶电泳检测，结果与预期相符（图2）。

2.2 CsPPH基因的生物学信息分析

利用在线软件ProtParam对基因进行蛋白质基本理化性质预测与分析，预测该蛋白相对分子质量为45 741.50 Da，编码413个氨基酸，理论等电点为6.12，包含6 481个原子，分子式为C2080H3247N555O591S8。其中，该蛋白氨基酸组成成分中亮氨酸（Leu）含量最高，占比14.0%；除了吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）占比为0以外，半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）占比最低，为1.0%。其半衰期在哺乳动物体外网织红细胞内为30 h，在酵母细胞内大于20 h，在大肠杆菌内大于10 h。CsPPH的消光系数为60 640，不稳定系数为41.72，为稳定蛋白，其脂肪系数为108.57。通过Prot Scale软件预测分析，CsPPH氨基酸残基在当前整个区域中所表现的疏水性要大于亲水性，而且大部分都处在正值的较高位置，该蛋白总平均亲水性为0.036，故CsPPH蛋白是偏向疏水性的，为疏水性蛋白（图3）。

TMHMM server 2.0预测显示该蛋白不存在跨膜结构（图4）。TargetP亚细胞定位预测结果表明该基因定位于叶绿体。SignalP 4.1 Server预测该蛋白序列无信号肽，属于非分泌性蛋白。NetPhos 3.1 Server对蛋白进行磷酸化位点分析预测（图5），结果表明，多肽链上共有41个磷酸化位点，分别为27个丝氨酸（Ser）位点，11个苏氨酸（Thr）位点和3个酪氨酸（Tyr）位点。磷酸化位点占全序列的9.9%，主要能够被cdc2蛋白（cdc2）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）和酪蛋白激酶I（CKI）等蛋白激酶磷酸化。FoldIndex软件可折叠性结果预测有序氨基酸残基数量占序列总比例的76.7%，判断其为有序蛋白。采用SCRATCH Protein Prodictor预测CsPPH二级结构，结果显示：α-螺旋占76.88%，β-折叠占0.08%，无规则卷曲占23.04%。使用Phyre2对该蛋白三级结构进行预测（图6），该模型基于可溶性环氧化物水解酶的晶体结构（c3i28A）进行建模，二者相似度高达66%，其预测结果具有较高的可信度。通过NCBI-CDS在线分析基因的保守结构域（图7），发现其编码的氨基酸序列中含有PLN02679结构域，属于PLN02679超级家族。

2.3 CsPPH基因进化树构建

将该蛋白的氨基酸序列进行BLASTp比对，结果显示，其与多个物种的PPH蛋白序列均有较高的相似性，相似率在70%以上。利用MEGA 7.0对选取的20条相似度较高的序列进行进化树分析，结果显示（图8），茶树聚在A类，与莲（）的关系最近，与莲、博落回（）、葡萄（）、芝麻（）的PPH蛋白相似性分别达到88%、80%、79%和77%。利用Jalview软件对CsPPH蛋白与其他植物PPH蛋白进行氨基酸序列比对，结果显示（图9），该蛋白在各种植物中具有高度保守性。

注：黄色阴影部分为起始密码子ATG和终止密码子TAG，灰色阴影部分表示PLNO2679保守结构域，黑色下划线为编码区

注：M：DNA分子标准量，1：CsPPH基因PCR产物

图3 CsPPH氨基酸序列亲/疏水性分析

图4 CsPPH蛋白的跨膜螺旋区

图5 CsPPH磷酸化位点预测

2.4 不同遮荫处理下白鸡冠茶树叶绿素含量的变化

由表3和图10可得知，遮荫处理后，白鸡冠茶树叶片的叶绿素含量均高于不遮荫白化叶片。随着遮荫天数的增加，白鸡冠叶片的叶绿素含量极显著上升，第6天含量最高，达到26.98。不遮荫处理的叶片变化不显著，恢复光照的叶片叶绿素含量显著下降，第6天低至14.30。试验表明，遮荫显著影响白鸡冠新梢白化叶片的叶绿素含量。

图6 CsPPH蛋白质三级结构

图7 CsPPH蛋白功能性位点分析

图8 CsPPH氨基酸序列进化树分析

注：方框表示超家族的保守结构域PLN02679；A：美花烟草（XP 009792199.1）；B：烟草（XP 019264379.1）；C：芝麻（XP 011096167.1）；D：茶树(MK359094)；E：莲（XP 010252240.1）；F：博落回（OVA05823.1）；G：川桑（XP 010112231.1）；H：土瓶草（GAV71596.1）；I：大桉（XP 010063750.1）

2.5 茶树CsPPH基因在不同遮荫处理下的表达模式分析

采用实时荧光定量PCR技术，分析白鸡冠茶树基因在不同遮荫处理下的相对表达量差异。由图11所示，基因在进行遮荫处理后的相对表达量下调，在遮荫第2天达到最低水平。在不遮荫处理中，相对表达量在第1天和第2天上调，且在第1天达到最高水平，在第3天至第6天处于下调。在恢复光照处理的白鸡冠中，相对表达量始终上调，第1天表达量最高。通过SPSS 22.0软件进行相关性和单因素方差分析得到，在不同处理后白鸡冠叶片中基因的相对表达量与叶绿素含量呈极显著负相关（=–0.647；=0.007<0.01）。

表3 不同处理下的白鸡冠SPAD值

注：不同大写字母表示在0.01水平上差异显著，小写字母表示在0.05水平上差异显著

Note: Different majuscule indicate significant difference at 0.01 level, different minuscule indicate significant difference at 0.05 level

图10 不同处理下白鸡冠茶树二叶SPAD值

注：与不遮荫和恢复光照叶片相比，*：差异显著（P<0.05）

3 讨论

植物叶色白化突变产生机制非常复杂，涉及到很多调控途径和代谢过程，以及内外部环境的共同作用等[26]。光敏型白化茶树白鸡冠作为特殊的茶树种质资源，其转录模式与常规绿叶品种有很大不同，白化叶色研究有助于叶绿素代谢、叶绿体发育及光合系统的研究，同时也是分子育种的典型材料[25]。白鸡冠茶树对光强较为敏感，叶绿体发育不全，叶绿素含量较其他绿叶品种少。

本研究从茶树中成功克隆到1个基因，该基因开放阅读框为1 241 bp，编码413个氨基酸，并且含有PPH酶特征序列和α/β水解酶折叠。该蛋白为疏水性蛋白质，无跨膜螺旋区，预测亚细胞定位于叶绿体。在对其他植物基因的研究中发现，所有的PPH蛋白质都存在α/β水解酶折叠，其主要氨基酸序列显示的很多区域在成员之间有高度的保守性，且PPH酶催化反应时都位于叶绿体内[21]。

叶绿素的积累在植物体内以动态的形式存在[30-31]，是一个合成与分解的综合过程。自然强光条件下，白鸡冠茶树随着光照时间的增加，叶片SPAD值基本没有变化，而遮荫处理的叶片SPAD值线性上升，表现为正常光照的叶色变白，而遮荫处理的叶片明显转绿。表明正常光照条件下白鸡冠茶树白化叶片叶绿素含量维持在一个较低的水平，而遮荫处理使得叶片的叶绿素含量上升，叶片呈现绿色。这与Fan等[32]的研究相符，他们通过代谢组和蛋白质组研究，阐释了光强对黄金芽光合色素代谢及光合系统的影响，发现黄化叶色的产生是由于光照条件下，黄金芽的叶绿素合成降低，而降解增多，导致叶片黄化。白鸡冠茶树白化叶片遮荫后，体内防御酶活性上升，清除由过剩光能产生的活性氧的能力增强，使之从光氧化损伤状态恢复，重组和修复叶绿体类囊体膜结构，使叶绿素能够正常合成。强光胁迫下，白化叶片防御酶活性低，不能清除由过剩光能产生的活性氧，造成膜损伤，导致类囊体膜结构降解，附着于其上的叶绿素降解，产生白化表型。这与低温敏感型白化茶树“安吉白茶”相似[33]。

基因是叶绿素降解机制的一个重要组成部分。在进行不同遮荫处理后，白鸡冠第二叶基因的表达显著下降，结合SPAD检测结果，表明是脱镁叶绿素a向脱镁叶绿酸a的降解过程受阻，使得叶片中脱镁叶绿素a累积，叶绿素降解过程受阻，导致叶绿素累积，叶片复绿。这与李旭敏[34]的研究相符，黄金芽叶绿素合成途径相关酶基因的抑制性表达，以及降解途径相关酶基因的高表达是引起其总叶绿素含量低的主要原因。植物叶片衰老也与叶绿素降解有关。黄瓜[21]、大豆[35]等叶片衰老时，其叶绿素降解，含量减少，基因表达量显著增加，叶色转黄。在本研究中，遮荫叶片在恢复光照后叶绿素的含量开始下降，相对表达量上调，说明光照对白鸡冠的表达有显著的调控作用。

本文结合叶绿素含量、基因克隆和相对表达量的研究结果，初步阐释了叶绿素降解对白鸡冠的白化机制起到关键作用。今后可以从分子角度深入把控白化机制，分离并研究具有潜在应用价值的基因，对白化突变体的遗传改良具有十分重要的意义[15]。但是叶绿素降解酶的特性及分子生物学的研究还很少，其在降解过程中去植基的过程相当复杂，亟需进一步挖掘。

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Cloning and Expression Analysis ofGene in Tea Plant ()

ZHOU Zhe1,2,4, CHEN Zhidan2,3,4, WU Quanjin5, XU Yilan3, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Collaborative Innovation Center of Modern Agriculture Industrial Park of Anxi County, Quanzhou 362400, China; 3. College of Tea, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 4. Engineering Technology and Research Center of Fujian Tea Industry, Fuzhou 350002, China; 5. Department of Finance and Management, The Open University of Fujian, Fuzhou 350002, China

Pheophytinase (PPH) is a key enzyme in chlorophyll degradation. It can convert pheophytin a into pheophorbide a, which is the last product to keep green in chlorophyll degradation pathway. This step is considered to be a key step of leaf senescence and yellowing. In this study, the full-length sequence ofgene was cloned from the new shoot leaves of albino tea plantcv. Baijiguan (MK359094), and its biological characteristics were analyzed. The full-length ofwas 1 298 bp, and the ORF was 1 241 bp, encoding 413 amino acids. Sequence analysis indicated that the encoded protein was a stable hydrophobic protein, and its molecular weight was predicted to be 45 741.50 Da. Its theoretical isoelectric point was 6.12. It was mainly located in chloroplasts. The real-time fluorescence quantitative PCR showed that under shading conditions, the expression ofwas inhibited, chlorophyll increased and leaf color turned green. Light promoted the expression ofin leaves of cv.Baijiguan, and chlorophyll degradation led to leaf albinism.

albinism of tea plant,gene, clone, bioinformatics analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)01-039-12

2019-06-10

2019-09-02

国家自然科学基金项目（31770732）、农业农村部资助项目——福建省安溪县现代农业产业园建设（KMD18003A）、2017年福建省科技计划项目（2017N3012）

周喆，女，硕士研究生，主要从事茶树栽培育种与分子生物学方面的研究，742382124@qq.com。

swj8103@126.com