饲喂大豆异黄酮对荷斯坦犊牛免疫及抗氧化性能的影响

肖 凡，李建洲，李 明，余 雄,2，邵 伟,2*

(1.新疆农业大学 动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆肉乳用草食动物营养重点实验，新疆 乌鲁木齐 830052)

犊牛的培育是奶牛养殖业持续健康发展的重点，增强犊牛免疫和抗氧化性能，促进犊牛高效健康生长，以期提高奶牛生产性能，创造更大的经济效益。大豆异黄酮(soy isoflavone,SIF)是天然存在于豆科植物中最具雌激素作用的化合物之一[1]。众多的研究均表明，SIF作为一种有效的生理调节剂，能够不同程度地影响鼠[2-5]、鸡[6-7]、鸭[8-9]、猪[10-13]、羊[14-16]、牛[17-19]等动物的生长、免疫、抗氧化性能。但不同剂量SIF对奶牛，尤其是犊牛的报道极少，需进一步研究。本试验通过以SIF作为荷斯坦犊牛饲料添加剂，探究其对犊牛免疫及抗氧化性能的影响，同时探讨SIF在犊牛日粮中的适宜添加量和饲喂时间，旨在为进一步推进荷斯坦犊牛饲养模式的优化提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点于2018年11月至2019年1月在新疆天山畜牧生物工程股份有限公司良种繁育场(新疆昌吉市榆树沟镇)进行试验。

1.2 试验动物及试验设计试验选择自然分娩、出生胎次为1～3胎、(30±10)日龄(d)、体况良好、体质量50 kg左右、饲喂足量初乳和酸化乳的荷斯坦犊牛40头。随机分为4组，每组10头。对照组(CON)每日3次，每次饲喂2 L全脂酸化乳，开食料自由采食；试验Ⅰ组(TGⅠ)、试验Ⅱ组(TGⅡ)、试验Ⅲ组(TGⅢ)分别在CON组饲喂的基础上添加100，300，600 mg/d SIF。试验分两个阶段，预试阶段7 d及正试阶段60 d，共67 d。分别于正试期0，20，40，60 d晨饲前对犊牛测体质量，计算0～20，20～40，40～60 d的日增重。每日进行犊牛粪便评分，每周统计腹泻率。分别于正试期0，30，60 d时采集犊牛10 mL颈静脉血液样本于2支5 mL真空采血管中。血样室内静置30 min，3 500 r/min离心15 min分离出血清后，分装于1.5 mL灭菌离心管，-20℃保存待测。试验结束后血清样本送至北京华英生物技术研究所测定免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等免疫指标和过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等抗氧化指标。

1.3 试验材料本试验SIF提取物由西安华庚生物科技有限公司提供，有效纯度为98%。

1.4 饲养管理试验期间，犊牛全期单栏饲养，饮水、饲料干净卫生，水温、奶温保持恒定，定期清洗消毒饲槽和奶瓶。对照组与试验组在相同的环境条件下，结合犊牛采食习惯，于每日4:00、11:00和17：00 饲喂全脂酸化乳2 L，开食精料自由采食，自由饮水，试验组犊牛每日10:00投喂对应量SIF。定时清粪、更换垫草，保持圈舍干净卫生。开食精料由新疆天康饲料科技有限公司提供，精料日粮营养水平见表1。

表1 精料日粮营养水平(风干基础) %

1.5 数据统计原始数据在Excel 2016中初步整理后，使用SAS University Edition统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)及关于重复测量数据(Repeated Measurement Date)的MIXED模型进行分析，差异显著采用DUNCAN’S法进行多重比较。统计分析以P<0.01表示差异极显著图中标示**；P<0.05表示差异显著图中标示*；P>0.10则表示差异无显著意义图中无标示。

2 结果

2.1 饲喂SIF对犊牛免疫相关指标的影响由表2和图1可知，试验组IgA在试验全期极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于其他各组(P<0.01)。在试验30 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于其他各组(P<0.01)，TGⅡ组显著高于TGⅠ组(P<0.05)。在试验60 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组显著高于TGⅠ组(P<0.05)。

试验组IgG在试验全期极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于TGⅠ组(P<0.01)。在试验30 d时，TGⅢ组极显著高于CON组(P<0.01)且显著高于TGⅠ、Ⅱ组(P<0.05)。在试验60 d时，TGⅡ、Ⅲ组显著高于CON组(P<0.05)。

在试验30 d时，TGⅡ、Ⅲ组IgM极显著高于CON组(P<0.01)，TGⅠ组显著高于CON组(P<0.05)，其他各期各组间无显著性差异(P>0.05)。

表2 不同浓度SIF对犊牛免疫球蛋白水平的影响 g/L

由表3和图2可知，TGⅡ、Ⅲ组IFN-γ在试验0 d极显著低于CON组(P<0.01)，在试验60 d显著高于CON组(P<0.05)。

在试验60 d时，TGⅢ组IL-1β显著高于CON组(P<0.05)。

在试验60 d时，TGⅡ、Ⅲ组IL-4极显著高于CON组(P<0.01)，TGⅢ组极显著高于TGⅠ组(P<0.01)。

试验组TNF-α在试验全期极显著低于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著低于其他各组(P<0.01)。在试验30 d时，TGⅢ组极显著低于CON组(P<0.01)，TGⅠ、Ⅱ组显著低于CON组(P<0.05)。在试验60 d时，TGⅡ、Ⅲ组极显著低于CON组(P<0.01)，TGⅠ组显著低于CON组(P<0.05)，其中TGⅢ组极显著低于TGⅠ组(P<0.01)且显著低于TGⅡ组(P<0.05)。

综上所述，其他各期各组间均无显著性差异(P>0.05)。

2.2 饲喂SIF对犊牛抗氧化指标的影响由表4和图3可知，试验组CAT在试验全期显著低于CON组(P<0.05)。在试验30 d时，试验组显著低于CON组(P<0.05)，其中TGⅡ组极显著低于CON组(P<0.01)且显著低于TGⅠ、Ⅲ组(P<0.05)。在试验60 d时，TGⅢ组极显著低于其他各组(P<0.01)，TGⅡ显著低于CON组(P<0.05)。

试验组GSH-Px在试验全期极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅡ、Ⅲ组显著高于TGⅠ组(P<0.05)。在试验30 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅡ组显著高于TGⅠ组(P<0.05)。在试验60 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于TGⅠ组(P<0.01)。

图1 不同浓度SIF对犊牛免疫球蛋白水平的影响

试验组T-AOC在试验全期极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于其他各组(P<0.01)。在试验30 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)。在试验60 d时，TGⅢ组极显著高于其他各组(P<0.01)，其中TGⅠ组显著高于CON组(P<0.05)。

试验组SOD在试验全期极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于TGⅠ组(P<0.01)。在试验30 d时，试验组极显著高于CON组(P<0.01)，其中TGⅢ组极显著高于TGⅠ组(P<0.01)。

试验组MDA在试验全期极显著低于CON组(P<0.01)，其中TGⅠ组显著低于TGⅡ、Ⅲ组(P<0.05)。在试验30 d时，试验组极显著低于CON组(P<0.01)，其中TGⅠ组显著低于TGⅡ、Ⅲ组(P<0.05)。

除上所述，其他各期各组间均无显著性差异(P>0.05)。

表3 不同浓度SIF对犊牛相关细胞因子水平的影响 ng/L

图2 不同浓度SIF对犊牛相关细胞因子水平的影响

表4 不同浓度SIF对犊牛抗氧化指标的影响 U/L

图3 不同浓度SIF对犊牛抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 饲喂SIF对犊牛免疫相关指标的影响血清IgA、IgG和IgM水平是反映动物机体体液免疫功能的重要指标，血清IFN-γ、IL-1β、IL-4、TNF-α等细胞因子水平也能不同程度地反映动物机体免疫性能。本试验结果发现，在试验全期各试验组IgA、IgG极显著高于CON组(P<0.01)，TNF-α极显著低于CON组(P<0.01)，在试验各期试验组IgM、IFN-γ、IL-1β、IL-4极显著或显著高于CON组(P<0.01或P<0.05)，说明SIF可显著提高血清IgA、IgG、IgM、IFN-γ、IL-1β、IL-4水平，降低TNF-α含量，有效提高荷斯坦犊牛免疫性能。同时本试验结果显示，相同时间相同剂量下SIF对荷斯坦犊牛血清中不同免疫指标影响不同。目前SIF的免疫调节机理暂无明确解释。现有研究报道，SIF具有弱雌激素样功能作用于免疫器官和细胞的雌激素受体，影响机体内分泌，对机体特异性免疫与非特异性免疫产生影响[20]。大量研究证实SIF通过刺激T淋巴细胞(T-lymphocyte)的增殖，促进分泌胸腺素(thymosin)、γ-干扰素(IFN-γ)，增强自然杀伤细胞(natural killer cell)活性，直接或间接地影响B淋巴细胞(B-lymphocyte)分泌和作用，增强机体细胞免疫和体液免疫功能。SAKAI等[21]发现SIF类植物雌激素能提高转基因小鼠血清IFN-γ和IL-4水平。陈丽[22]研究也发现饲喂SIF能显著提高雌性巴马香猪血清IgG水平，降低血清TNF-α含量，血清IL-1α、IL-2水平也有不同程度的提高。大量动物试验都发现SIF能提高鼠[3-5]、肉鸡[7]、肉鸭[8]、猪[13]、羊[14]、奶牛[17-19]等动物免疫性能，这些研究均与本试验结果相吻合。

本试验结果发现，血清IgA、IgG、IgM、IL-4水平随SIF添加剂量增加呈上升趋势，血清TNF-α含量随SIF添加剂量增加呈下降趋势，TGⅢ组血清IgA、IgG、IgM、IL-4水平最高，TNF-α含量最低。相同时间不同剂量SIF对血清IgA、IgG、IgM、IFN-γ、IL-1β、IL-4、TNF-α均产生了不同的影响。有研究报道IL-4能够增加免疫球蛋白的分泌水平[23-24]，这与本试验结果一致。郝振荣等[18]在泌乳后期奶牛和乳腺肥大细胞的试验均表明，SIF能够调控奶牛乳腺免疫，提高IL-4和IgG的水平，且IL-4的增加程度随剂量增加而改变。郑立等[25]在30日龄荷斯坦犊牛日粮中添加250 mg/d SIF研究其对免疫的影响，试验组血清IgA和IgG显著提高。这些研究与本试验结果相吻合。说明SIF对机体免疫性能的调控在一定程度上遵循剂量效应，且在本试验条件下饲喂剂量在600 mg/d时效果最好。

本试验结果还发现，TGⅢ组血清IgA、IgM、IgG、TNF-α在试验30 d时即出现显著，IFN-γ、IL-1β、IL-4在试验60 d时出现显著影响。由此推测SIF对荷斯坦犊牛免疫性能的调控在一定程度上遵循时间效应，且对血清中不同免疫指标产生作用的时间不同，在本试验条件下饲喂剂量在600 mg/d时间30 d即可显著提高荷斯坦犊牛免疫性能。但是关于SIF对动物机体作用时间的报道较少，未见犊牛的相关文献报道，仍需进一步探讨。

3.2 饲喂SIF对犊牛抗氧化指标的影响本试验结果发现，试验组在试验全期GSH-Px、T-AOC、SOD均极显著高于CON组(P<0.01)，CAT显著低于CON组(P<0.05)，MDA极显著低于CON组(P<0.01)；说明SIF可极显著提高血清GSH-Px、T-AOC、SOD活性，降低血清MDA含量，有效提高荷斯坦犊牛的抗氧化能力。关于SIF的抗氧化性能国内外已有报道，机体在正常情况下，自由基的生成、利用和清除处于动态平衡的状态，当自由基生成过剩或清除不足时，会破坏细胞功能，导致机体氧化损伤和各种疾病[26-27]。SIF的抗氧化作用主要通过清除机体过量自由基维持机体内平衡和提高抗氧化酶活降低MDA含量减轻氧化损伤等途径实现。井乐刚等[28]研究发现SIF有清除羟自由基(-OH)的作用，对超氧自由基(.O2-)也有一定的清除作用。郑灵芝等[29]研究也发现，SIF对二苯代苦味酰基自由基(DPPH-)、羟基自由基(-OH)、H2O2均有一定的清除作用且能够抑制亚油酸过氧化。大量动物试验也证明SIF能够提高机体抗氧化性能。冯敬晶[30]在热应激大鼠日粮中补饲SIF试验28 d后显著提高了血清GSH-Px活性，降低了MDA含量。李德生等[11]研究发现SIF能显著提高泌乳母猪血清GSH-Px、T-AOC、SOD、CAT活性同时降低血清MDA含量。方洛云等[31]在奶牛日粮中补饲SIF显著提高了GSH-Px、SOD活性，对CAT含量没有显著影响。刘续航等[32]的研究也得到了相同的结果。刘德义等[19]的研究发现SIF除了显著提高奶牛血清GSH-Px、T-AOC、SOD的活性降低血清MDA含量外，还显著提高了血清CAT活性。前人关于SIF对动物机体GSH-Px、T-AOC、SOD、MDA等抗氧化指标的影响与本试验结果基本一致。对血清CAT活性得到了不同的结果，推测可能因为试验动物生理状态和环境差异所造成的。

本试验结果发现，血清GSH-Px、T-AOC、SOD活性随SIF添加剂量增加呈上升趋势，血清MDA含量随SIF添加剂量增加呈下降趋势，TGⅢ组血清GSH-Px、T-AOC、SOD的活性最高，MDA含量最低。说明SIF对机体抗氧化性能的调控在一定程度上遵循剂量效应，且在本试验条件下饲喂剂量在600 mg/d 时效果最好。井乐刚等[28]研究发现SIF对羟自由基(-OH)的清除能力随浓度的增大而增强。刘德义等[19]分别添加0，5，60，70 mg/kg SIF，结果显示饲喂最高剂量70 mg/kg SIF的组血清CAT、SOD活性最高MDA含量最低，抗氧化性能最好。这些研究与本试验结果相吻合。

本试验结果还发现，TGⅢ组在试验30 d时，血清GSH-Px、T-AOC、SOD、MDA即出现显著影响。说明在本试验条件下SIF饲喂剂量在600 mg/d时间30 d即可显著提高荷斯坦犊牛抗氧化性能。方洛云等[31]饲喂30 mg/kg SIF试验35 d时显著提高了泌乳奶牛血清抗氧化性能。刘续航等[32]的研究也得到了相同的结果，这与本试验结果接近。刘德义等[19]在奶牛日粮中补饲70 mg/kg SIF试验10 d时GSH-Px、SOD、CAT活性显著提高MDA含量显著降低。由此推测SIF对机体抗氧化性能的调节不仅受剂量影响，还受到作用时间影响。在实际生产中还需根据动物品种、生理状态、环境、成本等众多因素进一步探讨适宜剂量和饲喂时间。

综上所述，饲喂SIF可显著提高血清IgA、IgG、IgM、IFN-γ、IL-1β、IL-4水平，降低血清TNF-α含量，在本试验条件下饲喂剂量600 mg/d饲喂时间30 d能够有效提高荷斯坦犊牛免疫性能。饲喂SIF可显著提高血清GSH-Px、T-AOC、SOD活性，降低血清MDA含量，在本试验条件下饲喂剂量600 mg/d饲喂时间30 d能够有效提高荷斯坦犊牛抗氧化性能。