结肠癌组织中miR-29b、Tiam1 的表达及临床意义

杨晓波 吴 淼 彭孟寅 李 岗 左 强

1.四川省宜宾市第二人民医院胃肠外科，四川宜宾 644000；2.安徽省亳州市人民医院胃肠外科，安徽亳州 236800

结肠癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，具有较高的发病率与死亡率，近几年随着人们生活方式的改变，结肠癌发病率呈现逐年增长及年轻化的趋势[1-2]。肿瘤淋巴转移是结肠癌患者死亡的主要原因，结肠癌发病机制较为复杂且尚未明确[3-4]。MicroRNA（miRNA）是一类由18～25 个氨基酸组成的非编码小分子RNA[5]，其能够与靶向基因mRNA 上的特定序列互补配对，促使mRNA 发生降解或者抑制翻译的进行[6]。miRNA 与肿瘤的发生发展相关，是一种具有组织高度特异性的肿瘤标志物[7]，其在多种组织中表达异常下调[8]，miR-29b 作为miRNA 中的一大家族，在多种肿瘤如胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[9]中表达降低；T 淋巴瘤侵袭和转移诱导因子1（Tiam1）是鸟氨酸转换因子（GEFs），参与多种肿瘤的侵袭和转移，在甲状腺癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达，其表达与肿瘤细胞的侵袭转移关系密切[10]，但是关于miR-29b 和Tiam1 在结肠癌中的表达情况的文献报道较少。本研究主要探究结肠癌中miR-29b、Tiam1 的表达情况及临床意义，为临床结肠癌的治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年5 月～2018 年5 月在四川省宜宾市第二人民医院（以下简称“我院”）行手术治疗的结肠癌患者，纳入标准：①患者符合中国结直肠癌诊疗规范[11]；②病理检查确诊为结肠癌，具备结肠癌典型的临床症状；③患者术前未接受过任何肿瘤治疗；④具有完整的病历资料；⑤患者及其家属同意参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①患有严重心血管疾病及肝肾功能不全者；②患有其他类型恶性肿瘤；③患有自身免疫疾病、严重感染疾病者。

选取符合纳入标准的患者81 例，男45 例，女36 例；年龄39～80 岁，＜50 岁患者38 例，≥50 岁患者43 例，平均年龄（58.35±8.92）岁；肿瘤直径：＜6 cm 39 例，≥6 cm 42 例；细胞分化程度：低分化24 例，中、高分化57 例；淋巴结转移50 例，无淋巴结转移31 例；TNM 分期按照国际抗癌联盟肿瘤TNM 分期图谱：Ⅰ～Ⅱ期64 例，Ⅲ期17 例。本研究通过我院医学伦理委员会审核、批准。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol 试剂购自北京拜尔迪生物技术有限公司；反转录试剂盒TransScript Two-Step RT-PCR Super Mix（生产批号：M20105）和qRT-PCR 试剂盒TransStart Top Green qPCR SuperMix（生产批号：J21018）均购自北京全式金生物技术有限公司；本研究涉及引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.3 miR-29b 和Tiam1 在不同组织中的表达

手术中选取结肠癌患者癌组织、距离癌组织边缘5 cm 外癌旁组织标本切除后立即放置于液氮中，转移至-80°C 冰箱保存，液氮速冻，取100 mg 左右的组织，研磨成粉末，利用Trizol 试剂提取总RNA，获得的RNA 立即放置于冰上，利用紫外分光光度计，检测RNA 的浓度与质量。取1 μg RNA（剩余RNA 储存于-80°C 冰箱），按照TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix 试剂盒操作说明书，将提取得到的RNA 反转得到cDNA，反转得到的cDNA 保存于-20℃冰箱。采用Real-time PCR 对miR-29b 和Tiam1 进行相对定量分析，qRT-PCR 扩增采用TransStart Top Green qPCR SuperMix 试剂盒，PCR 反应体系参照说明书进行，STBR Premix Ex Taq Mix 17 μL，模板1.0 μL，上游与下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，总体系为20 μL。反应程序：95℃3 min，95℃30 s，55℃30 s（每次循环后采集荧光），进行35 个循环。数据分析利用Bio-Rad CFX Manager 软件，判断RT-PCR 产物的特异性可以根据溶解曲线，相对定量分析采用2-ΔΔCt方法进行分析。定量PCR 所用引物：miR-29b 上游引物序列5′-GCGCGCTAGCACCATTTG-3′，下游引物序列5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；其内参引物U6 上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。Tiam1 上游引物序列5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3′，下游引物序列5′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′，其内参引物GAPDH上游引物序列5′-ACTTCAACAGCGACACCCACT-3′，下游引物序列5′-GCCAAATTCGTTGTCATACCAG-3′，每个样品重复3 次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；采用Pearson 相关系数进行相关性分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-29b 和Tiam1 在不同组织中的表达分析

miR-29b 在癌组织中的表达量显著低于癌旁组织（P ＜0.05），Tiam1 在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 不同组织中miR-29b 和Tiam1 的表达水平比较（）

表1 不同组织中miR-29b 和Tiam1 的表达水平比较（）

2.2 结肠癌患者组织中miR-29b、Tiam1 表达与患者临床病理特征的关系

结肠癌患者组织中miR-29b、Tiam1 表达与肿瘤TNM 分期、分化程度以及淋巴结转移情况相关（P ＜0.05），与患者年龄、性别、肿瘤直径无关（P ＞0.05）。见表2。

2.4 癌组织中miR-29b mRNA 与Tiam1 mRNA 表达的相关性

癌组织中miR-29b mRNA 与Tiam1 mRNA 表达呈负相关y=-9.472x+8.981（r=-0.381，P ＜0.05）。见图1。

表2 结肠癌患者组织中miR-29b、Tiam1 表达量与患者临床病理特征的关系（）

表2 结肠癌患者组织中miR-29b、Tiam1 表达量与患者临床病理特征的关系（）

图1 miR-29b mRNA 与Tiam1 mRNA 表达的相关性

3 讨论

miRNA 在肿瘤的发生、侵袭等过程中发挥着重要作用，作为一种具有调控功能的小分子RNA[12]。miR-29 家族在多种肿瘤中充当着抑癌基因的角色，其能够抑制肿瘤的发生、发展，促进细胞凋亡，具有免疫调节作用[22]。miR-29a、miR-29b、miR-29c 是miR-29 家族主要成员，其中miR-29b 是miR-29 家族最重要的成员，miR-29b 能够调控不同分子的表达，调控各种类型分子在细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等不同阶段的表达，促进机体参与各项生命活动，故miR-29b可以作为多种肿瘤增殖、扩散等过程的信号分子[13]。Tiam1 由小鼠T 淋巴瘤细胞中鉴定得到，含有1591 个氨基酸，含有DH 与PH 两个功能结构域，是一种原癌基因[14]。Tiam1 是最重要的GEFs 成员之一，能够调节Rho 蛋白家族活性，影响细胞骨架形成、调控基因表达，在细胞周期进程、细胞迁移及黏附等生命活动过程中起到重要作用[14]。

大量研究表明，miR-29b 能够在胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等[9]肿瘤细胞中表达，但是在不同肿瘤细胞中表达量有所差异。miR-29b 的表达受多种因素调控影响，如缺失表达、其他miRNA 的调控以及染色体的不稳定性等[15]。本研究中，miR-29b 在结肠癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，提示miR-29b 可能参与结肠癌的发生发展，表现出抑癌基因的功能。MiR-29b 可能是由于启动子区域CpG 岛甲基化沉默，被充当抑癌基因的角色，miR-29b 能够通过RISC 机制结合靶基因上的3′UTR，并下调该基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的进一步增殖、扩散、侵袭、迁移以及促进细胞凋亡[16-17]，充当抑癌基因的角色，参与结肠癌的发生、发展。进一步分析发现，结肠癌患者组织中miR-29b 的表达与肿瘤TNM 分期、细胞分化程度以及淋巴结转移密切相关，说明miR-29b 与结肠癌的转移、分化、扩散密切相关，在肿瘤形成与凋亡过程中发挥着重要作用。

Tiam1 作为GEF 家族成员，是肿瘤发生、发展的潜在调节因子，其在甲状腺癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达[10]，本研究显示Tiam1在结肠癌中表达量高于癌旁组织，且与TNM 分期、细胞分化程度以及淋巴结转移密切相关，提示Tiam1 能够参与诱导结肠癌转移等过程，表现出癌基因的作用，其表达能力与肿瘤的转移能力密切相关，其诱导转移机制可能与以下几点密切相关：①膜褶皱强弱与细胞侵袭、转移能力呈正相关。研究表明，外源过表达Tiam1 后，膜褶皱比例显著增加，说明Tiam1 能够诱导膜褶皱增加，促进癌细胞的转移、发展[19]。②Tiam1 PH区能够参与蛋白与蛋白之间的相互作用，形成蛋白复合物，确定Tiam1 蛋白在细胞膜上的定位结果，影响细胞的黏附分子[20]。③Racl 能够影响肌动蛋白的细胞骨架的组成，而Tiam1 在体内外均能够特异性地激活Racl，影响细胞骨架的组装，进而影响细胞运动、黏附以及形态的变化等[21]，Tiam1 诱导机制决定了Tiam1 在肿瘤发生、发展过程中的作用，其能够表现癌基因的作用，其表达量的变化能够指示癌组织的扩散、发生、发展等过程，具有良好的指示作用。

相关性分析结果显示，结肠癌组织中miR-29b与Tiam1 表达呈负相关，可能是因为miR-29b 可能直接作用于Tiam1，激活Tiam1-Rac 信号，miR-29b 与Tiam1 共同作用，促进结肠癌细胞的发展。褚庆华等[22]研究发现miR-29c 通过Tiam1 抑制人食管鳞状细胞癌的转移与侵袭，改变细胞的运动状态，与本研究结果相似。Wang 等[23]发现Tiam 1 是miR-29b 的直接靶点，与miR-29b 修复诱导的表型不同，Tiam1 诱导的细胞增殖和迁移部分地挽救了miR-29b 介导的生物学行为，说明两者相互作用，在结肠癌分子治疗中具有潜在的价值。

综上所示，miR-29b 在结肠癌患者低表达，而Tiam1 则高表达，两者相互作用共同参与结肠的发生发展及转移。