液液萃取-气相色谱法快速测定发酵液中的己酸含量

赵晨婕，潘明，*，刘念，王超凯，3，4，常少健，3，4，张翼，3，4，刘义会，3，4，郭杰，3，4，蔡海燕，3，4，李觅，3，4，余航，3，4，孙中理，3，4，李斌

（1.四川轻化工大学，四川自贡643000；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130；3.酿酒生物技术及应用四川省重点试验室，四川成都611130；4.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000；5.泸州和荣酒业有限公司，四川泸州646000）

己酸乙酯是浓香型白酒的主要香味物质[1-3]，其具有菠萝以及香蕉样香气，且香气阈值很低[4-6]。在浓香型白酒特定的酿造环境下，己酸乙酯主要是在窖池内由己酸菌产生的己酸和酵母菌产生的乙醇通过微生物的酯化作用合成的[7-10]。在己酸菌培养液中，己酸等有机酸的组成及其含量往往随菌种的种类、纯度和发酵工艺的变化而变化[11-12]，分析其中的有机酸组成与含量对开发己酸菌菌种资源、完善己酸菌发酵生产工艺条件和科学地指导白酒生产都具有极其重要的意义。因此，在己酸菌的筛选、培养过程中如何快速、准确测定发酵液中的己酸等有机酸的含量是非常值得研究的[13-17]。

目前测定己酸菌发酵液中己酸的方法主要有：比色法和气相色谱法。比色法主要原理是，硫酸铜与发酵液中的己酸反应呈蓝色，己酸含量越高蓝色越深，通过测定溶液OD 值算出己酸含量[18]。该法虽然操作简便，但是试验过程中萃取剂为乙醚，对环境和人体的伤害较大[19]；气相色谱法对白酒中的有机酸含量检测较为准确，但是发酵液中的己酸存在于水相中，提取己酸的方法影响到检测的准确性[20]。发酵液经蒸馏后，在毛细管色谱柱上直接进样检测[21]，由于己酸沸点较高，直接蒸馏提取效率低，造成的误差较大，经乙醇溶解，甲酯化处理后再蒸馏，馏出液直接进气相色谱检测，虽然结果较准确，但甲酯化的过程时间较长，操作复杂[22]。本研究主要考察利用有机溶剂液液萃取-气相色谱法快速定量测定己酸菌发酵液中己酸含量方法的稳定性，为进一步的试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

己酸菌发酵液：食品发酵实验室自备；氯化钠（分析纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、己酸（色谱纯）、2－乙基正丁酸（色谱纯）、乙醇（色谱纯）：西陇化工厂；0.45 μm 微孔滤膜：津腾试验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 6820 气相色谱仪配氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）、P/N5190-1483 进样针、白酒分析专用色谱柱（型号FFAP）：美国Agilent 公司；ALC-110.4 电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 内标物溶液制备

精密量取2-乙基正丁酸2 mL 至100 mL 容量瓶，使用60%的色谱级纯乙醇定容，混匀，制得0.368 g/L的内标物溶液，备用。

1.3.2 样品预处理方法

量取适量样品，调节溶液pH 值，用移液管移取5 mL 玻璃试管中，加入2 g 氯化钠，振荡混匀。用大肚移液管精确移取10 mL 萃取剂加入玻璃试管中。上下摇晃10 次～15 次，放于试管架静置30 min 后。吸取上清液经0.45 μm 微孔滤膜过滤至5 mL 容量瓶中，定容，加标100 μL，待上机测定。

1.3.3 气相色谱分析条件

色谱柱：白酒分析专用色谱柱（型号FFAP）（50 m×0.25 mm×0.5 μm）。

程序升温：初始温度47 ℃，保持5 min，以4.5 ℃/min的速率升温至70 ℃，再以5 ℃/min 的速率升温到98 ℃，维持 1 min，以 5 ℃/min 的速率升温至 145 ℃，以5 ℃/min 的速率升温至 190 ℃，以 10 ℃/min 的速率升温至230 ℃，保持15 min；汽化室温度250 ℃；检测器温度 250 ℃，载气为高纯氮气（N2），柱流速：3 mL/min；分流比为 1 ∶1；进样量：0.6 μL；进样模式：分流；进样方式：手动进样；数据分析：Agilent Cerity QA-AC 工作站软件。

2 结果与分析

2.1 己酸保留时间的确定

将己酸对照品处理后加内标100 μL，上机测定。色谱图见图1。

由图1 可知，内标物和对照品均独立出峰，2-乙基正丁酸和己酸保留时间分别为27.219 min 和28.962 min。

2.2 萃取剂选择

分别以乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷作萃取剂，萃取同一发酵液中的己酸。按照1.3.2 节方法提取制备供试液，并按1.3.3 节条件进行气相色谱法分析，记录己酸峰面积。每种萃取剂做3 个重复试验，结果见图2。

相同浓度己酸溶液分别用相同体积乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷萃取，色谱峰面积可反映出不同萃取剂的萃取效果，峰面积越大说明该溶剂对己酸的萃取效果越好。由图2 可知，3 种萃取剂萃取效果差异显著（P＜0.05）。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，己酸平均峰面积为117.78，二氯甲烷的萃取效果次之，己酸平均峰面积为107.18，正己烷萃取效果最差，己酸平均峰面积为88.44。综上所述，选取乙酸乙酯为萃取剂进行后续试验。

2.3 发酵液pH值调节

图1 己酸出峰时间Fig.1 Peak time of caproic acid

图2 萃取剂萃取己酸效果Fig.2 Effect of extractant on caproic acid extraction

图3 对己酸测定影响Fig.3 Effect of pH value on determination of caproic acid

由于己酸菌发酵产生的己酸会与发酵液中的物质发生反应，以盐的形式存在于水相中，有机溶剂无法萃取，因此需调节发酵液的pH 值，利用强酸制弱酸的原理将己酸置换出来。以试验室常用的硫酸和盐酸作为备选pH 值调节剂。通过试验发现，硫酸与萃取剂乙酸乙酯不互溶，盐酸与萃取剂乙酸乙酯互溶。因此采用硫酸调节溶液pH 值不会对色谱柱造成损害。以1.5 mol/L 的硫酸将溶液 pH 值分别调整为 5、4、3、2、1，测定己酸含量的变化。每个试验重复做3 个，结果见图3。

由图3 可知，发酵液pH 值从5 降低至2 的过程中，己酸含量从55.5 mg/100 mL 升至286.8 mg/100 mL，显著升高。当pH 值达到2 时，再继续降低pH 值到1，己酸变化不显著。说明pH 值为2 时，发酵液中己酸从盐的形式完全被置成酸。因此需要将发酵液pH 值调节至2，才能使己酸以游离态存在，保证后续检测准确。

2.4 精密度试验

精密度试验考察浓度为55.0 mg/100 mL 的己酸溶液，用乙酸乙酯作萃取剂，按照1.3.2 节方法进行样品前处理，进行气相色谱法分析，分别平行测6 次，结果见表1。

表1 己酸精密度试验结果（n=6）Table 1 Precision tests results of caproic acid

由表1 可知，已知浓度为55.0 mg/100 mL 的己酸溶液6 次测定结果在55.0 mg/100 mL～60.6 mg/100 mL之间，平均值为57.3 mg/100 mL，相对标准偏差RSD=3.46%，结果表明该方法精密度高。

2.5 加标回收率试验

向浓度为129.6 mg/100 mL 的己酸菌发酵液中分别加入 50.0、100.0、150 mg/100 mL 的己酸标品，混匀。以乙酸乙酯作萃取剂按照1.3.2 节方法进行样品前处理，进行气相色谱法分析，每个浓度做3 个平行试验，结果见表2。

由表2 可知，向浓度为129.6 mg/100mL 的发酵液中添加3 个浓度的己酸标品，回收率在98.19%～104.43%之间，相对标准偏差RSD 在2.19%～3.51%之间，己酸菌发酵液的pH 值低，且成分复杂，干扰因素多，该方法的回收率在80%～120%范围内，相对标准偏差RSD 小于5%，说明该方法准确度良好。

表2 己酸加标回收率试验结果Table 2 Adding standard recovery rate tests results of caproic acid

3 结论

在相同的己酸标准物添加量以及相同的气相色谱条件下，使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷3 种不同的有机试剂作为萃取剂，萃取效果差异显著。其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，检出己酸平均峰面积为117.78。pH 值为2 时，发酵液中己酸从盐的形式完全被置成酸，此时己酸检出含量最为准确。本试验测定己酸的平均回收率在98.19%～104.43%之间，相对标准偏差RSD 在2.19%～3.51%之间，表明该方法准确度良好。