南极磷虾中氟的赋存形态及分析方法研究进展

沙鸥，刘华，鲍佳琦，崔博文，陈丽，王志，覃干景

（1.江苏海洋大学化学工程学院，江苏连云港222005；2.江苏省海洋资源开发研究院（连云港），江苏连云港222005；3.江苏海洋大学海洋生命与水产学院，江苏连云港222005；4.江苏深蓝远洋渔业有限公司，江苏南通226100）

南极磷虾（Euphausia superba），又名大磷虾或南极大磷虾，是一种小型的海洋浮游虾状甲壳类动物。南极磷虾在南极生态系统中处于中心位置，是初级生产者和顶端捕食者之间的桥梁。南极磷虾生物量约为6.5 亿吨～10 亿吨，是地球上最丰富的动物物种之一，也是人类重要的后备蛋白库[1-2]。南极磷虾具有高蛋白、低脂肪、含有人体所必需的全部氨基酸等特点，吸引了一些国家对南极磷虾进行规模化的商业捕捞，并对南极磷虾保鲜、生物活性物质提取、虾油、虾膏、虾糜及虾粉的加工工艺等进行了研究[3-6]。由于南极磷虾具有广阔的应用前景，我国研究者也加大了对南极磷虾的研究[7-11]。

尽管南极磷虾富含蛋白质与多种微量元素，有研究发现该类虾中氟含量极为丰富，且虾壳（包括甲壳和尾足）＞头胸部＞肌肉，南极磷虾各部分氟含量如表1所示。高氟含量不仅制约了南极磷虾的加工与安全利用，也限制了南极磷虾产业的发展[12-14]。各国研究者近年来陆续对南极磷虾中氟的赋存形态与含量进行了研究[15-18]。由于生物体对不同形态氟化物吸收存在差异，对生物体产生的毒性也不尽相同，故仅检测虾中氟元素的总量并不能作为评价其安全性的指标。本文系统阐述了国内外文献报道的南极磷虾中氟的赋存形态、南极磷虾及其产品中氟的前处理方式以及分析检测方法，为南极磷虾中的氟的赋存形态与含量检测提供一定的科学依据与理论基础，为南极磷虾的开发利用提供技术支持。

表1 南极磷虾的各部位氟的含量（干重）Table 1 Fluorine content of various parts of antarctic krill（dry weight）

1 南极磷虾中氟的形态

化学形态分析是对元素的各种存在形式，包括游离态、共价结合态、络合配位态、超分子结合态等进行定性和定量的分析[21]。关于南极磷虾中氟的赋存形态，研究者有按不同的样品前处理方式对氟进行形态划分，也有研究者将土壤中氟的形态分类直接应用于南极磷虾中氟的形态分析研究。

根据样品的前处理方式不同，研究者对氟的形态划分存在多种方式。潘建明等[15]以10%KOH 甲醇溶液（甲醇∶水=9 ∶1，体积比））为提取液对南极磷虾粉中的氟进行提取，提取液经加热消解，将氯仿萃取、活性炭吸附及滤纸吸附的消解液中的氟统归纳为有机氟，水相中氟为无机氟，并提出南极磷虾中有机态氟是以弱结合态的形式存在，无机态氟主要是以钙磷无机盐Ca5（PO4）3F 形式存在。曹明秀等[22]分别以盐酸与水（1 ∶11，体积比）和去离子水为提取液对冷冻南极磷虾的氟进行浸提，把盐酸浸提液中的氟称为总氟，去离子水中氟称为游离态氟，除游离态氟以外的统称为结合态氟。韦强等[23]采用去离子水对南极磷虾粉进行浸提，并将水提液中氟称为水溶性的氟。张倩[24]对南极磷虾油进行低温碳化与高温灰化样品前处理后，将灰化残留物中的氟称为总氟。李红艳[25]对南极磷虾酶解液进行离心与滤膜分离预处理，滤液中的氟用0.1 mol/L 高氯酸进行浸提，并将高氯酸浸提液中的氟称为总氟，具体分类如表2 所示。

吴卫红等[30]采用Tisser 逐级连续提取法把土壤中的氟分为水溶态氟、可交换态氟、铁锰结合态氟、有机态束缚氟以及残渣态氟。赵晓君等[16]采用该分类法对南极磷虾中的氟进行赋存形态研究（表3），并发现水溶态氟和可交换态氟具有较强的迁移和转化特性，对生物体具有较高的有效性；该课题组采用离子选择电极法对南极磷虾粉中氟的赋存形态进行定量研究[31]，发现人体可吸收的水溶态氟和可交换态氟占南极磷虾体内总氟含量的都较低，该结果为南极磷虾的食用安全性评价提供了理论依据。

表2 南极磷虾氟的前处理Table 2 Pretreatment of antarctic krill fluoride

2 南极磷虾样品前处理方法

由于南极磷虾中氟的存在形式多样化，故对不同形态氟进行测定前需对样品进行预处理。目前文献报道南极磷虾中氟的前处理方法有灰化-蒸馏法、水浸提法、酸浸提法等。

表3 南极磷虾氟的形态分类[16]Table 3 Morphological classification of fluoride in antarctic krill

灰化-蒸馏法是一种较为经典的样品前处理方法[26]，可用于南极磷虾及其副产品中总氟含量测定。南极磷虾样品用硝酸镁与氢氧化钠浸泡，浸泡液经低温碳化与高温灰化后，在酸性条件下蒸馏，用氢氧化钠溶液吸收蒸馏出的氟化物，而后对无机态氟离子进行检测。朱碧英等[20]采用此法对南极磷虾全虾中氟进行提取，采用氟试剂比色法测得总氟含量为1 220 mg/kg，但该法操作繁琐，敞开式的体系容易导致氟损失。

水浸提法是直接采用去离子水对虾样品中氟进行浸提，提取液中的氟被称为水溶性氟。韦强等[23]采用料液比 1 ∶60（g/mL），浸提温度 65 ℃，超声时间 40 min作为提取南极磷虾水溶性氟的最佳条件，测得水溶性氟的含量为（435±5）mg/kg。

酸浸提法是指采用不同无机酸对虾中的氟进行浸提的方法，目前文献报道的主要盐酸浸提与高氯酸浸提两种。盐酸浸提法操作简单，直接于虾样品中加入1 mol/L 盐酸进行浸提，提取出的氟称为酸溶性氟，盛晓风等[29]采用该法对虾肉中氟进行浸提，测得氟含量为419.8 mg/kg；高氯酸浸提与盐酸浸提的不同之处是高氯酸浸提法不仅可以提取酸溶性氟，还可提取南极磷虾体内弱结合态的有机态氟[15]，李红艳等[25]采用该法检测南极磷虾酶解液氯化钙法脱氟前后氟含量，经氯化钙沉淀法南极磷虾酶解液中氟离子质量浓度由 66.6 mg/L 降至 8.3 mg/L。

3 南极磷虾中氟的检测技术

3.1 氟离子选择电极法

氟离子选择电极法的原理是氟化镧对氟离子产生选择性的对数响应，氟电极和饱和甘汞电极在被测试液中产生电位差，根据能斯特方程计算出溶液中氟离子浓度[26]。氟离子选择电极法（ion selective electrode ISE）因其选择性好、适用范围宽、快速准确、操作简便、经济等优点[32-34]，成为目前氟离子测定的最经典方法。

Soevilk 等[19]首次发现南极磷虾富氟特性，并采用氟离子选择电极法测得南极磷虾总氟含量为2 400 mg/kg，此后各国学者[4，35-36]采用该法陆续开展南极磷虾中富氟特性的研究工作。1991 年张海生等[37]以氟离子选择电极法测得南极磷虾总氟含量为1 232 mg/kg，且虾体内氟存在形式主要以钙磷无机盐，而非Buchholz[38]报道的几丁质结构。由于南极磷虾中氟含量较高，对于国标氟离子选择电极法测氟需对样品稀释50～100 倍后方可测定，稀释过程加大了试验误差。盛晓风等[29]对国标法GB/T5009.18-2003《食品中氟的测定》-氟离子选择电极法进行改良，分别吸取低浓度（10.0 μg/mL）、中浓度（100.0 μg/mL）以及高浓度（1 000.0 μg/mL）氟标准液代替了国标中1.0 μg/mL 氟标准溶液，将标准曲线的线性范围由 0.02 μg/mL～0.2 μg/mL 扩展至0.04 μg/mL～50.0 μg/mL，减小对于南极磷虾这种高氟产品检测的误差。赵彦玲等[28]对用国标氟离子选择电极法测南极磷虾中氟含量的数据进行处理，发现试验数据精密度低，因此从加大取样量和采用标准溶液添加法绘制标准曲线这两方面进行优化。由于南极磷虾体内氟含量分布不均，加大取样量可以提高样品的代表性，提高试验精密度。标准溶液添加法是连续添加200 μL 的1.0 mg/mL 氟标准溶液，分别计算对应溶液的浓度，代替国标法分别吸取不同体积的氟标准液绘制标准曲线，减小试验误差、时间及试剂。

3.2 分光光度法

氟试剂比色法的原理是无机态氟离子（F-）与氟试剂（茜素氨羧络合剂）、硝酸镧在酸性条件下反应生成蓝色三元络合物，氟离子浓度在一定范围内与该三元络合物的吸光度成正比[26]。

1988 年朱碧英等[20]采用氟试剂比色法对南极磷虾全虾以及不同部位氟含量进行测定，研究结果表明氟在南极磷虾体内的富集特征为：虾壳（包括甲壳和尾足）＞头胸部＞肌肉，测定结果与Soevilk 选用氟离子电极法基本一致。由于南极磷虾的高氟特性，样品经灰化蒸馏处理后，溶液中氟浓度超出国标GB/T5009.18-2003 检测范围，故赵彦玲等[28]从检测波长、溜出液稀释倍数等多方面对进行氟试剂比色法进行了优化，研究确定了检测最佳波长以及最佳稀释倍数，从而减少试验误差。

3.3 离子色谱法

离子色谱法（ion chromatography，IC）是 20 世纪70年代发展起来的一种新的液相色谱技术，主要用于水溶液中无机态氟离子（F-）的含量测定。该法采用阴离子交换分离柱分离氟离子与其他离子成分，以碳酸钠一碳酸氢钠溶液为淋洗液，硫酸溶液为再生液，用电导检测器对F-进行检测[39]。该法具有准确度高、选择性好、检出限低、重复性好、操作简单等优点，被广泛应用于矿石、地表水、茶叶以及牙膏等物质中氟含量测定[40-43]。

Zhao Y L 等[44]首次采用离子色谱法对南极磷虾中氟含量进行测定，并对不同浸提方式（包括水浸提、硫酸蒸馏、盐酸浸提以及盐酸浸提液中加入总离子强度调节缓冲液剂）对于离子色谱测定F-的影响进行研究，研究结果表明，水浸提法仅能提取水溶性的F-，盐酸浸提法中引入的大量氯离子对色谱分离柱伤害较大，盐酸浸提法中加入总离子强度调节缓冲剂，不仅引入大量氯离子，且缓冲剂中的乙酸根离子与氟离子色谱峰重叠，而硫酸蒸馏法尽管引入了硫酸根离子，但氟离子与硫酸根离子保留时间相差较大，达到基线分离，故硫酸蒸馏更适用于南极磷虾中氟化物的测定。Shen 等[27]采用1 mol/L 盐酸溶液对冷冻干燥后南极磷虾粉浸提，浸提1 h，浸提液中F-含量用离子色谱法进行测定，测得虾中可溶性氟含量为（2 122.8±64.8）mg/kg，该法与Zhao 报道的方法相比，在进样系统前增加了净化程序（Ag+柱）以消除氯离子的干扰。

4 南极磷虾产品中氟的检测

南极磷虾庞大的资源量是南极磷虾商业化开发的最大动力，目前南极磷虾产品较为普遍的产品存在形式有饲料级磷虾粉、虾油、酶解液[12-13]，因此这些产品中的氟含量的检测同样受到研究者的广泛关注。

饲料级磷虾粉富含氨基酸、磷脂、虾青素、多不饱和脂肪酸等营养物质，被广泛应用于水产饲料行业。Yoshitomi 等[45]采用氟试剂比色法对南极磷虾粉喂养的虹鳟背部肌肉以及椎体内氟离子含量进行测定，试验结果表明随着南极磷虾粉喂养时间增加，虹鳟脊椎体内氟化物含量增加，并对虹鳟的生长起到了抑制作用。Hansen 等[46]选择氯化钙作为钙补充剂对降低虹鳟吸收磷虾壳中氟化物进行研究，通过氟离子选择电极法对虹鳟血浆中氟含量进行监测。

虾油富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等[47]物质，是人体自身不能合成但又不可缺少的重要营养物，因此南极磷虾油被广泛应用于营养保健和制药等行业。阴法文等[48]选用氯化钙、氧化钙、活性炭和活性粘土等作为吸收剂对南极磷虾虾油中的氟化物进行去除研究，氟离子去除率通过氟离子选择性电极法来进行监测。郭彤等[49]以乙醇、丙酮、正己烷为提取溶剂，采用离子色谱法对不同批次提取的虾油以及油渣中的氟化物进行检测分析，试验结果表明乙醇提取的虾油中氟的含量最低。

南极磷虾酶解液是指南极磷虾在生物酶的酶解作用下形成的富含短肽和氨基酸的酶解液，具有抗氧化、清除自由基、抑制有害菌、预防骨质疏松的功能食品[50-52]。杨晓丹等[53]研究在竹炭中加Fe2（SO4）3溶液合成的改性竹炭对南极磷虾酶解液中氟离子脱氟率，脱氟率通过氟离子选择性电极法来进行测定。

5 结论及展望

目前，随着对南极磷虾资源的开发利用，科研工作者对南极磷虾氟的形态分析和含量测定的不断深入研究，南极磷虾及其产品中氟的检测方法得到重视。文中提到的测定南极磷虾及其产品中氟的3 种方法均存在一定的缺点，不同方法所得到的分析数据在可靠性和可比性等方面仍存在不少问题，如何建立兼顾准确度和灵敏度的南极磷虾氟前处理方法和仪器检测技术，值得进一步研究。