酸解法制备五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质的工艺

郑洪伟，冯佳，吴杰，王鑫彤，陈慧，王乐，曹曦，张菲，郭雷，2，*

（1.江苏海洋大学江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港 222004）

微生物活动是引起生鲜水产品腐败变质的主要原因。冷藏是延长水产品货架期的最常用的方法，但仍有少数微生物能在低温下生存繁殖并产生腐败异味和臭味的代谢产物，这样的微生物称之为特定腐败菌[1-2]。研究表明，在有氧冷藏条件下，腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是大黄鱼、带鱼和南美白对虾等水产品冷藏过程中特定腐败菌之一[3-4]。腐败希瓦氏菌归属于弧菌科希瓦氏菌属（Shewanella），是嗜冷性的革兰氏阴性运动杆菌，其能把氧化三甲胺还原为三甲胺，产生硫化氢，腐败时出现酸臭味等异味，最终导致水产品的腐败变质[5]。

中草药因其不易产生抗药性、药物残留低、毒副作用小，在替代抗生素资源开发方面引起了越来越多的重视和关注[6-7]。五倍子为漆树科植物盐肤木（Rhus chinensis Mill.）、青麸杨（Rhus potaninii Maxim.）或红麸杨（Rhus punjabensis Stew.var.sinica （Diels）Rehd.et Wils.）叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜（Melaphis chinensis（Bell）Baker）寄生而形成[8]。五倍子是我国传统中药之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、防龋、抗癌、护肝、止泻、抗炎、抗凝血等活性，已被农业部批准用于水产动物细菌性疾病的防治[9-11]。五倍子的主要化学成分为鞣质和没食子酸。鞣质又称鞣酸、单宁酸，是五倍子的主要成分，含量可达70%[12]。五倍子鞣质是一混合物，是一分子葡萄糖与1～10 个分子的没食子酸缩合而成[13-14]。没食子酸是五倍子的主要有效成分，在五倍子中的含量约为2%～4%，其可通过水解五倍子鞣质而得[15-16]。

本研究对酸解法制备五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质过程中影响五倍子提取液抗菌活性的4 个主要影响因素（盐酸浓度、酸解温度、酸解时间和液料比）进行单因素试验，在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken 试验设计和响应面法对酸解法制备五倍子抗菌物质的工艺进行优化，以期为进一步鉴定和开发五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五倍子：安徽亳州中药厂，经粉碎机粉碎后，过40目筛备用；腐败希瓦氏菌QL-1（Shewanella putrefaciens），由江苏海洋大学微生物天然产物化学实验室保存；牛肉膏、蛋白胨、琼脂、盐酸、氢氧化钠均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

QJ32W1000A 型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅：金坛市荣华仪器制造有限公司；DUG-9240D 型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；BS 124S 电子分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；GL25M 型低温高速离心机：金坛区金城春兰实验仪器厂；RE-52A 型旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂；CCA-20 型低温冷却水循环泵：上海一凯仪器设备有限公司；SHZ-D（III）型循环水真空泵：巩义市予华仪器有限公司，YXQ-LS 型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

单因素试验中分别考察盐酸浓度、酸解温度、酸解时间和液料比对五倍子提取物抗菌活性的影响。

盐酸浓度：称取5 份五倍子粉1.0 g 放入锥形瓶内，各加入 2、3、4、5、6 mol/L 的盐酸溶液 20 mL，摇匀，使盐酸与五倍子粉末充分混合，于80 ℃水浴酸解3 h。酸解液经抽滤后，取滤液用4 mol/L NaOH 调pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 离心10 min，上清液即为五倍子提取液。取上清液测定抗菌活性。

酸解温度：称取5 份五倍子粉1.0 g 放入锥形瓶内，并加入3 mol/L 的盐酸溶液20 mL，混合均匀，分别于 60、70、80、90、100 ℃水浴酸解 3 h。酸解液经抽滤后，取滤液用4 mol/L NaOH 调pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 离心10 min，取上清液测定抗菌活性。

酸解时间：称取5 份五倍子粉1.0 g 放入锥形瓶内，并加入3 mol/L 的盐酸溶液20 mL，混合均匀，于100 ℃水浴分别酸解 1、2、3、4、5 h。酸解液经抽滤后，取滤液用4 mol/L NaOH 调pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 离心10 min，取上清液测定抗菌活性。

液料比：称取5 份五倍子粉1.0 g 放入锥形瓶内，并分别加入 3 mol/L 的盐酸溶液 10、20、30、40、50 mL，混合均匀，于100 ℃水浴酸解3 h。酸解液经抽滤后，取滤液用4 mol/L NaOH 调pH 值至中性，定容到100 mL，然后于5 000 r/min 离心10 min，取上清液测定抗菌活性。

1.3.2 响应面法优化

在单因素试验的基础上，采用酸解温度100 ℃，以盐酸浓度、酸解时间和液料比为设计的3 个变量，五倍子提取液的抗菌活性为响应值，进行三因素三水平共17 个试验的Box-Behnken 设计（表1）。利用Design Expert 7.0 软件构建模型、分析方差及预测最优值[17]。

1.3.3 抗菌活性的测定

利用琼脂扩散法测定五倍子提取液的抗腐败希瓦氏菌活性[18]。将冷却至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入直径约90.00 mm 的培养皿内，每个培养皿加20mL 左右。培养基凝固后，取200μL1×106个/mL～2×106个/mL 腐败希瓦氏菌液均匀涂布于培养基上，放置20 min。然后在培养皿内放置牛津杯，将200 μL 待测液加入牛津杯内，32 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，试验平行进行3 次，抗菌活性大小以抑菌圈直径的平均值（mm）表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 盐酸浓度对五倍子提取物抗菌活性的影响

盐酸浓度对五倍子提取液抗菌活性的影响如图1所示。

图1 盐酸浓度对五倍子提取物抗菌活性的影响Fig.1 Effect of concentration of HCl on actibacterial activity of the extracts of Galla chinensis（GCE）

从图1 可以看出，当盐酸浓度在3 mol/L～4 mol/L时，五倍子提取液的抗菌活性保持在较高水平，因此在其他的单因素试验中，采用3 mol/L 的盐酸溶液进行酸解。

2.1.2 酸解温度对五倍子提取物抗菌活性的影响

酸解温度对五倍子提取液抗菌活性的影响如图2所示。

图2 温度对五倍子提取物抗菌活性的影响Fig.2 Effect of temperature on actibacterial activity of GCE

从图2 可以看出，随着温度的增加，五倍子提取液的抗菌活性也随之增大，100 ℃时最大，因此将酸解温度定为100 ℃。

2.1.3 酸解时间对五倍子提取物抗菌活性的影响

酸解时间对五倍子提取液抗菌活性的影响如图3所示。

图3 时间对五倍子提取物抗菌活性的影响Fig.3 Effect of time on actibacterial activity of GCE

从图3 可以看出，随着时间的增加，五倍子提取液的抗菌活性也随之增大，4 h～5 h 时趋于稳定，因此将3、4、5 h 定为响应面优化时酸解时间的3 个水平。

2.1.4 液料比对五倍子提取物抗菌活性的影响

液料比对五倍子提取液抗菌活性的影响如图4所示。

图4 液料比对五倍子提取物抗菌活性的影响Fig.4 Effect of liquid/material ratio on actibacterial activity of GCE

从图4 可以看出，随着液料比的增加，五倍子提取液的抗菌活性也随之增大，液料比为50（mL/g）时抗菌活性最强，因此将 40、50、60（mL/g）作为响应面优化时液料比的3 个水平。

2.2 响应面法优化

在单因素试验的基础上，酸解温度定为100 ℃，以盐酸浓度（2、3、4 mol/L）、时间（3、4、5 h）和液料比[40、50、60（mL/g）]为响应面法优化的 3 个因素及 3 个水平，五倍子提取液的抗菌活性为响应值（Y），进行总共17个试验的Box-Behnken 设计。试验设计变量因素的编码值、实际值及其响应值如表1 所示。利用Design Expert 7.0 软件进行模型构建和方差分析见表2。通过对试验数据进行多元回归分析，得出反映测试变量与响应变量关系的二阶多项式方程：

表1 Box-Behnken 设计方案与结果Table 1 Coded（actual）levels of the operational parameters and observed values of Box-Behnken design

表2 响应面分析试验方差分析结果Table 2 ANOVA for the quadratic response surface model

从表2 可以看出，模型的P 值小于0.05，而失拟项的P 值大于0.05，说明构建的模型是显著的，并且能用于变量优化的预测。液料比、盐酸浓度与温度的交互作用和盐酸浓度的二次项达到显著水平，时间的效应达到极显著水平，测试变量对响应变量的影响效应也可从其两两交互作用的响应面图进行观察（图5）。通过对上述方程进行回归分析，模型预测的最佳工艺为盐酸浓度4 mol/L、时间5 h 和液料比45 mL/g，预测的抗菌活性为22.63 mm。在最佳酸解工艺下进行验证试验，五倍子提取液的实际抗菌活性为（23.68±0.68）mm（n=4），与预测值没有显著差异，说明响应面法应用于优化酸解法制备五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质的工艺是可行的。

图5 两个因素交互作用的响应曲面Fig.5 Response surface plots for the interactions of two variables on actibacterial activity of GCE

3 结论

采用单因素试验、Box-Behnken 试验设计结合响应面法对酸解法制备五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质的工艺进行了优化，最佳的酸解工艺为：盐酸浓度4 mol/L、液料比45 mL/g、温度100 ℃时提取5 h。五倍子提取液的实际抗菌活性为（23.68±0.68）mm，与预测值（22.63 mm）没有显著差异，表明响应面法应用于优化酸解法制备五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质的工艺是可行的。本研究为进一步鉴定和开发五倍子抗腐败希瓦氏菌活性物质提供了依据。