miR-181a-5p调控IGF2BP2表达对胎盘滋养层细胞浸润、迁移能力的影响及机制

万淑梅，彭萍，高妍

中国人民解放军南部战区总医院，广州510010

子痫前期(PE)又称先兆子痫，是孕产妇和胎儿死亡的主要原因之一[1]。PE的病因目前尚未明确，但胎盘发育缺陷与之相关，而胎盘滋养层细胞增殖和入侵不足可导致胎盘发育异常和功能异常[2]。研究认为，增加胎盘滋养层细胞迁移和浸润能力是治疗PE的新策略[3]。因此，研究调控胎盘滋养层细胞迁移和浸润能力的关键因素至关重要。微小核糖核酸(miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，在细胞生长、分化和运动等正常生理活动中发挥重要调控作用[4]。据文献报道，miRNA的异常表达谱在PE患者的脐带血、血清、胎盘组织和间充质干细胞中均有发现[5]。肿瘤进展和胎盘发育过程有许多共同的特征，包括迁移和浸润。miR-181a-5p是肿瘤相关抑制因子，参与肝细胞肝癌、非小细胞肺癌和胶质瘤等的增殖、转移等恶性生物学行为[6～8]，其对胎盘滋养层细胞迁移和浸润能力的影响引起我们的关注。miRNA的调控机制是通过其靶基因发挥作用[9]，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP2)是一种癌基因，而Wnt/β-catenin是经典的信号通路。2017年1月～2019年1月，我们分析了miR-181a-5p对IGF2BP2的调控作用，观察其对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo浸润、迁移的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆转录、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-181a-5p、IGF2BP2、内参U6和GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HTR-8/SVneo细胞由加拿大皇后大学的Graham教授实验室馈赠；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；miR-181a-5p mimic和过表达IGF2BP2质粒购自广州瑞博公司；6孔板和Transwell购于美国Coring公司。Wnt1、β-catenin抗体购自英国Abcam公司。

1.2 miR-181a-5p靶向调控IGF2BP2的生物信息学预测与验证 用TargetScan7.1软件(http://www.targetscan.org/)预测miR-181a-5p的靶基因，观察miR-181a-5p与IGF2BP2的3′非翻译区(3′UTR)是否存在结合位点。以PCR将IGF2BP2野生型(wt)和突变型(mut)全长3′-UTR片段进行扩增后，插入到pGLO载体中构建pGLO-IGF2BP2-wt和pGLO-IGF2BP2-mut。将HTR-8/SVneo细胞以4×103/孔接种96孔板中，分为干预组和对照组，接种12 h后采用Lip2000分别同时转染miR-181a-5p(空白对照NC)与野生型或突变型IGF2BP2 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因pGLO载体；转染48 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶报告基因活性。

1.3 胎盘组织中miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA检测 采用qRT-PCR法。经医院医学伦理委员会同意后，收集在2015年10月～2016年12月入住我院妇产科行剖宫产分娩产妇的胎盘组织，其中PE患者和正常妊娠产妇各30例。受试者均签署知情同意书，均为单胎妊娠，未患有全身性疾病。PE产妇年龄(31.12±2.02)岁，正常妊娠产妇年龄(30.12±3.24)岁，两者基本资料具有可比性。将新鲜胎盘组织液氮冷冻后，加入TRIzol裂解液，提取组织总RNA。细胞系采用PBS洗涤3次后，加入TRIzol裂解液，提取细胞总RNA。设计合成引物：miR-181a-5p上游为5′-CCGCGAACATTCAACGCTGTCG -3′、下游为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，U6上游为5′- CAAATTCGTGAAGCGTTCCATAT-3′、下游为5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′；IGF2BP2上游为5′-AGTGGAATTGCATGGGAAAATCA-3′、下游为5′-CAACGGCGGTTTCTGTGTC-3′，GAPDH上游为5′-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3′、下游为5′-CGCCCCACTTGATTTTGG-3′。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆转录体系将总RNA逆转录为cDNA，并将其作为模板，95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、65 ℃退火30 s共40个循环。使用7500 real-time PCR检测各样品的循环阈值(Ct)，计算方法为2-ΔΔCt。以U6为内参计算miR-181a-5p相对表达量，GAPDH为内参计算IGF2BP2 mRNA相对表达量。

1.4 细胞培养与分组转染 采用含10% FBS的RPMI1640培养基培养HTR-8/SVneo细胞，置于37 ℃、5 %CO2培养箱中培养；细胞融合度达90%以上时，按1∶3进行传代。选处于对数生长期、生长状态良好的细胞消化计数，以1.5×105/孔接种6孔板，分为NC组、miR-181a-5p过表达组和miR-181a-5p+IGF2BP2过表达组。接种12 h后用Lip2000进行转染，分别转染无关序列、miR-181a-5p mimic、miR-181a-5p mimic+IGF2BP2过表达质粒；置于培养箱中培养，12 h更换新鲜培养基。

1.5 细胞中IGF2BP2 mRNA检测 取各组细胞，采用qRT-PCR法检测IGF2BP2 mRNA，方法同1.3。

1.6 细胞浸润能力观察 采用Boyden实验。将无血清培养基和BD基质胶以10∶1的比例进行稀释，取45 μL加入Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，置于37 ℃培养箱中备用。收集各组细胞，以细胞1×106/孔、100 μL无血清培养基接种于基质胶上，下室加入500 μL含10% FBS的培养基。10 h后终止培养，以PBS将未穿过的上室细胞洗去；穿过的细胞经甲醇固定，苏木素染色，显微镜下计数细胞个数。

1.7 细胞迁移能力观察 采用Transwell实验。在Transwell小室中无需加基质胶，将1×106个细胞直接接种于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，细胞只需穿过膜上的微孔，其余步骤同Boyden实验。

1.8 细胞中Wnt1、β-catenin蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，加入蛋白裂解液完全裂解细胞；4 ℃下12 000 r/min离心20 min，将上清液移至新的EP管中，并检测蛋白浓度；煮沸变性后，各组加入相同质量的蛋白上样进行SDS-PAGE电泳；湿转，5% BSA室温封闭PVDF膜2 h；加入Wnt1和β-catenin一抗稀释液4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，采用ECL化学发光法曝光蛋白条带。

2 结果

2.1 miR-181a-5p靶向调控IGF2BP2的生物信息学预测与验证结果 TargetScan7.1软件在线预测显示，IGF2BP2启动子区存在miR-181a-5p的结合位点，见表1。双荧光素酶报道基因试验显示，与对照组比较，干预组能降低野生型IGF2BP2 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性(P<0.05)，但对突变型IGF2BP2 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性无明显影响(P>0.05)。见表2。

表1 miR-181a-5p与IGF2BP2 mRNA 3′UTR结合位点预测结果

表2 miR-181a-5p对IGF2BP2 mRNA 3′UTR荧光素酶报告基因活性的影响

注：与对照组同型别比较，*P<0.05。

2.2 胎盘组织中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表达水平及二者的相关性 PE胎盘组织中miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA表达量分别为0.64±0.36、1.49±0.61，正常妊娠妇女胎盘组织中分别为0.85±0.34、1.02±0.28，两者miR-181a-5p、IGF2BP2 mRNA比较差异有统计学意义(P均<0.05)。Pearson分析结果显示，在PE胎盘组织中miR-181a-5p与IGF2BP2 mRNA表达呈负相关(r=-0.601,P<0.05)。

2.3 各组胎盘滋养层细胞中GF2BP2 mRNA表达比较 与NC组(1.00±0.10)比较，miR-181a-5p 过表达组(0.18±0.07)和miR-181a-5p +IGF2BP2过表达组(0.38±0.02)细胞中IGF2BP2 mRNA表达均降低(P均<0.05)；与miR-181a-5过表达组比较，miR-181a-5p +IGF2BP2过表达组细胞中IGF2BP2 mRNA表达增加(P<0.05)。

2.4 各组胎盘滋养层细胞浸润、迁移能力比较 与NC组比较，miR-181a-5p 过表达组和miR-181a-5p+IGF2BP2过表达组细胞浸润、迁移的穿膜细胞数减少(P均<0.05)；与miR-181a-5过表达组比较，miR-181a-5p +IGF2BP2过表达组细胞浸润、迁移的穿膜细胞数增多(P均<0.05)。见表3。

表3 各组胎盘滋养层细胞浸润、迁移能力比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与miR-181a-5p 过表达组比较，#P<0.05。

2.5 各组胎盘滋养层细胞Wnt/β-catenin信号通路水平比较 与NC组比较，miR-181a-5p 过表达组和miR-181a-5p+IGF2BP2过表达组细胞中Wnt1和β-catenin蛋白表达降低(P均<0.05)；与miR-181a-5p过表达组比较，miR-181a-5p+IGF2BP2过表达组细胞中Wnt1和β-catenin蛋白表达增加(P均<0.05)。见表4。

表4 各组胎盘滋养层细胞Wnt/β-catenin信号通路水平比较

注：与NC组比较，*P<0.05；与miR-181a-5p 过表达组比较，#P<0.05。

3 讨论

正常的胎盘功能是影响妊娠的重要因素，维持胎盘功能最重要的是胚胎滋养层细胞。滋养层细胞处于胚胎和母体血管系统之间的界面，在正常妊娠中，滋养层细胞通过蜕膜和子宫肌层的迁移，浸润至内皮和中膜的母体螺旋动脉，即间质和血管浸润；迁移和浸润是滋养细胞分化的主要途径，而滋养层细胞浸润不足或过度浸润均可能导致子宫胎盘灌注压降低和胎盘缺血/缺氧。缺血诱导的氧化应激同时引起胎盘的损伤和坏死以及胎盘因子释放，导致内皮功能障碍和全身性炎症，促使PE的发生，威胁孕妇和胎儿的生命健康[10]。PE主要特征为高血压和蛋白尿，并发肝、肾、脑和凝血系统等全身问题，妊娠20周后孕妇发生比例>30%[11]。因此，研究PE的发病机制、干预胚胎滋养层细胞的迁移和浸润能力对维持正常妊娠具有重要意义。

miRNA属于一类小的非编码RNA，在转录后水平的基因表达调控中发挥重要作用，miRNA广泛表达于各类组织中[4]。胎盘发育中的许多细胞过程，包括滋养层分化、迁移、浸润、增殖、凋亡、血管发生/血管生成和细胞代谢等均受到miRNA的调控[12]。miRNA表达异常可引起包括胎盘发育异常等多种疾病的发生[13]。胎盘组织中越来越多异常表达的miRNA被发现，miR-181a-5p是与血液系统中血管内皮细胞和淋巴细胞发生及分化相关的miRNA[14]。然而，miR-181a-5p也是与肿瘤恶性生物学行为密切相关的miRNA之一，其在肝细胞肝癌、非小细胞肺癌和胶质瘤等肿瘤组织中表达下调，并抑制肿瘤增殖和侵袭[6～8]。Huang等[15]报道，miR-181a-5p在PE胎盘组织中表达上调，并能引发抗细胞增殖和抑制细胞周期进程，诱导细胞凋亡，抑制细胞侵袭。胎盘发育和肿瘤进展有许多共同的特征，miR-181a-5p在肿瘤疾病和胚胎发育障碍中发挥的作用是一致的，具体的作用机制未明确。miRNA通过结合靶mRNA的3′-UTR中的互补位点，导致mRNA翻译抑制或者降解，抑制靶基因的表达发挥功能[9]。TargetScan7.1软件在线预测显示，IGF2BP2 3′-UTR存在miR-181a-5p的结合位点，可能是miR-181a-5p的靶基因。进一步采用双荧光素酶报道基因试验和qRT-PCR实验验证，IGF2BP2是miR-181a-5p的直接靶基因。

IGF2BP2在胰腺癌、结直肠癌和急性髓细胞白血病等肿瘤组织中高表达，促进肿瘤的增殖、侵袭和转移，并与患者的预后不良相关，被认为是促癌基因[16～18]。但IGF2BP2和PE与胎盘发育等相关研究未见报道，因此我们推测miR-181a-5p可能靶向负调控IGF2BP2抑制胎盘滋养层细胞迁移和浸润能力。首先，我们在组织水平检测miR-181a-5p和IGF2BP2 mRNA的表达情况，发现与正常妊娠胎盘组织相比，PE胎盘组织中miR-181a-5p表达下降，IGF2BP2 mRNA表达增加，且两者在PE胎盘组织中的表达呈负相关，提示miR-181a-5p可能靶向IGF2BP2的表达导致胎盘发育障碍。在细胞水平生物功能实验证实，miR-181a-5p抑制胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo的浸润和迁移能力，而增加IGF2BP2表达可减弱miR-181a-5p对胎盘滋养层细胞浸润和迁移能力的抑制作用，表明miR-181a-5p是通过靶向调控IGF2BP2基因发挥抑制胎盘滋养层细胞浸润和迁移的能力。Wnt/β-catenin信号通路是与肿瘤恶性进展密切相关的重要调控途径之一[19]。有研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在PE患者胎盘中被抑制，导致滋养层细胞侵袭和增殖能力降低，从而促进了PE的发生发展[20]。在本研究中，我们检测了Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt1和β-catenin的表达，发现miR-181a-5p可抑制Wnt/β-catenin信号通路，而IGF2BP2基因可以减弱miR-185a -5p对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用。

综上所述，在PE胚胎组织中miR-181a-5p表达下降，IGF2BP2基因表达增加。miR-181a-5p靶向负调控IGF2BP2基因可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性降低胎盘滋养层细胞的浸润和迁移能力，miR-181a-5p可能是干预PE进展的潜在靶点。