胞外囊泡在急性髓系白血病发生发展及诊治中作用的研究进展

周双雄，赵红丽，洪珞珈

哈尔滨医科大学附属第四医院，哈尔滨150000

胞外囊泡(EVs)是体内不同种类细胞膜来源的囊泡，包括从细胞膜表面释放的微粒(MPs，直径<1 000 nm)和来自细胞腔内的外泌体(直径30～100 nm)。最初，EVs被认为是没有真正生物学意义的细胞膜碎片；随着研究的深入，EVs在细胞间通过蛋白质、脂质和核酸的转移进行通信的重要性在许多研究中得到证实，参与包括肿瘤在内的各种疾病的发生。在急性髓系白血病(AML)中，越来越多研究表明EVs在其凝血异常、疾病进展、生物标志物及化疗耐药等多方面发挥作用。现综述如下。

1 EVs在AML发生发展中的作用

1.1 参与凝血异常 凝血异常是AML的重要并发症，出血主要与获得性血小板功能异常、循环抗凝血剂、内皮损伤和肝功能障碍有关，血栓主要与感染、组织因子(TF)、蛋白质C、MPs、炎性细胞因子等因素有关。

研究发现，MPs上暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)及TF，在机体凝血反应中发挥重要作用。PS为凝血复合物提供了催化表面，有助于凝血过程的起始和维持；TF通过与FⅦ/FⅦA的相互作用，启动外源性凝血级联反应，是体内凝血的主要生理引发因子。另外，MPs还能通过FⅫ/FⅪ依赖的方式激活内源性凝血途径启动凝血反应。MPs在AML的凝血活化中同样发挥重要作用。AML中MPs的促凝活性(PCA)较正常增高，主要是由于TF在MPs表面大量表达，从而触发了凝血级联反应[1]。研究发现，在急性早幼粒细胞白血病中，MPs的PCA明确与PS相关[2]，且部分化疗药物可能增加MPs的PCA[3]。此外，有研究表明EVs能降低TF通路抑制剂的表达，进一步促进凝血激活。

1.2 促进血管形成 MPs参与肿瘤血管生成的各个阶段，其表面存在促血管生成因子，并能刺激内皮细胞表达促血管生成因子[4]。在AML中，血管生成是白血病发生发展和化疗敏感性的重要因素。新诊断的AML患者骨髓血管增多与血管内皮生长因子(VEGF)高表达相关[5]。Huan等[6]研究表明，将AML细胞Molm来源外泌体与OP9细胞共培养后，VEGF转录水平升高。这提示在AML中细胞外泌体能通过刺激细胞表达VEGF，进而调节血管生成。近期研究发现，AML细胞来源的外泌体含有VEGF和VEGF受体(VEGFR)信使RNA，该信使RNA能在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中诱导VEGFR表达,促进HUVECs的成管活性，促进AML血管形成[7]。

1.3 抑制骨髓造血 骨髓造血功能异常导致血细胞减少是AML的常见表现，也是影响患者生存及治疗的一大难题。AML来源的外泌体可通过RNA来改变造血微环境内信号传导，进而对残余骨髓造血产生影响[6]。Hornick等[8]研究表明，外泌体可通过miRNA的传递下调包括c-MYB在内的关键造血调节因子，减少造血祖细胞的集落形成来抑制造血。此外，外泌体还可能通过使骨髓基质细胞支持因子和趋化因子失调，间接地调节造血干/祖细胞功能[9]。研究发现，AML来源的EVs相较于正常CD34+细胞miR-7977表达增高，转染miR-7977到间充质干细胞后，使多聚C结合蛋白1(PCBP1)转录后调节因子的表达降低，造血生长因子减少，导致骨髓CD34+细胞的造血支持能力下降。这提示EVs的miR-7977可抑制PCBP1，是导致正常造血减少的一个重要因素[10]。

1.4 改变骨髓造血微环境 骨髓造血微环境最早被认为是一种惰性结构，仅为骨髓造血干/祖细胞提供造血场所；后来研究发现，骨髓造血微环境的逐步重建是白血病发生的一个重要方面。AML克隆增殖不仅改变骨髓基质成分，而且抑制正常造血，这是患者发病和死亡的一个重要原因[11]。其中，AML外泌体对骨髓造血微环境的改变发挥重要作用。Peinado等[12]发现，将小鼠转移性黑色素瘤肿瘤细胞来源的外泌体转移到骨髓，可抑制正常造血，使骨髓造血微环境有利于肿瘤细胞生存。在AML中分泌的外泌体，能通过增加体内骨髓间充质细胞(MSC)的数量及促进其产生IL-8来改变骨髓造血微环境，促进疾病的发展及化疗耐药[13]。近期研究发现，AML中白血病细胞来源的外泌体处理的骨髓基质细胞使支持正常造血的基因(CXCL12、KITL、IL-7和IGF1)和成骨基因(OCN、Col1A1和IGF1)的表达降低，而支持AML生长的基因(DKK1、IL-6和CCL3)表达增高[14]。而且，白血病细胞外泌体可诱导从氧化磷酸化到无氧糖酵解的代谢转变。这种代谢改变和缺氧在白血病骨髓造血微环境中作用显著，进一步促进外泌体从母细胞和(或)间充质基质细胞释放，上调转化生长因子β1(TGF-β1)表达，激活AML细胞；并且，由此激活的CXCR4/SDF-1通路能抑制免疫细胞活性，同时增加E-选择素表达水平，其能调控细胞黏及其从骨髓向外迁移[15]。

1.5 影响免疫系统 正常情况下机体能免疫识别肿瘤细胞，诱导自然杀伤细胞(NK细胞)对自身肿瘤细胞进行清除。有研究表明，肿瘤来源的外泌体富含免疫抑制分子，包括FasL、PD-L1和TRAIL等死亡受体配体以及IL-10和TGF-β1等抑制因子[16]。体外实验表明，AML血浆中的外泌体通过下调NKG2D在正常人NK细胞中的表达水平，降低NK细胞毒性；用TGF-β1抗体中和AML外泌体源性的TGF-β1后，NK细胞功能部分恢复，提示外泌体源性的TGF-β1是AML中NK细胞功能障碍的可能原因[17]。Hong等[18]通过研究AML外泌体对过继免疫治疗的影响，进一步证实AML外泌体的TGF-β1可能通过与NK-92细胞上的TGF-β1受体结合来调节其细胞毒性；其研究还表明，外泌体所携带白血病相关抗原和介导免疫抑制的蛋白质，能抑制用于过继免疫治疗的NK-92细胞的细胞毒性、分化、增殖和向白血病细胞定向迁移，多方面影响NK细胞的功能。关于肿瘤中外泌体的许多研究表明，它们具有抑制NK细胞免疫活性的作用，也有研究表明它们能改变T细胞活性。Shen等[19]体外研究发现，经过HSP70阳性外泌体处理的树突细胞诱导的细胞毒性T细胞比未经过该外泌体处理者对白血病NB4细胞的杀伤作用更强。未来，白血病细胞源性外泌体可能作为一种体内免疫激活剂，在白血病的免疫治疗中发挥重要作用[20]。此外有研究表明，TGF-β1在AML的EVs上表达增多，可能有助于促进T细胞功能，因为TGF-β1在促进T细胞的分化和增殖中发挥作用[21]。AML的EVs能促进骨髓源性抑制细胞(MDSCs)的增殖，MDSCs是一组具有较强免疫抑制活性的未成熟骨髓细胞。MDSCs能通过精氨酸酶1和诱导型一氧化氮合酶的表达以及活性氧的产生下调T细胞受体，直接抑制效应CD8+T细胞功能[22]。因此，EVs具有多种免疫调节机制影响AML病情进展。

1.6 减少AML细胞凋亡 细胞凋亡是影响AML细胞存活的重要机制之一，细胞凋亡失调可能导致化疗耐药并最终复发。研究表明，Bcl-2和Bcl-2/Bax是AML细胞抗凋亡的决定因素，并且与AML患者的存活相关。可通过流式检测Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1和Bax这4个定量参数构成抗凋亡指数(AAI)，反映细胞的凋亡活性。Wojtuszkiewicz等[23]研究表明，高AAI的AML细胞分泌含有细胞因子的EVs可能被低AAI的细胞吸收，进而使低AAI的AML细胞AAI上调，抑制细胞凋亡，提示EVs介导的调控蛋白释放可能是AML细胞抗凋亡的机制之一。此外有研究表明，AML源性的EVs能通过参与细胞间信号传递，参与骨髓基质中MSC内质网应激反应来抑制细胞凋亡[24]。

2 EVs在AML诊治中的作用

2.1 EVs与AML诊断、治疗及预后 目前，AML诊断、微小残留(MRD)及预后监测，主通过骨髓穿刺术取骨髓组织来完成，侵入性大，且部分检查结果尚缺乏统一判定标准。EVs携带有亲代细胞特异性的蛋白、脂质、miRNA、mRNA或DNA等物质，其双层膜结构可使其负载的亲代细胞等物质能够在体液中相对稳定存在。因此，通过EVs及其携带物的检测，可能反映AML的疾病动态，使之有可能成为AML诊断、MRD及预后监测的潜在标志物；且相较于以往的检查手段，该方法可能更敏感、创伤更小，但也存在如检测方法不够准确等问题待解决。Kunz等[25]通过检测AML患者及AML细胞EVs来源的RNA，发现其数量变化与NPM1和FLT3-ITD突变相关，而NPM1和FLT3-ITD突变明确与AML发病及预后相关，可影响患者治疗方案选择，故AML细胞EVs来源RNA可能在AML诊断、治疗及预后评估中发挥作用。Hornick等[26]通过检测AML细胞与AML环境下基质细胞外泌体携带的特异miRNA，发现外泌体负载的miR155和其他miRNA与AML细胞数相关，这些miRNA可用于检测AML小鼠模型中的MRD；与传统细胞免疫分型监测MRD相比，外周血中的外泌体所含特异miRNA作为检测MRD的标志物具有更高灵敏度。随着研究结果的不断更新，白血病EVs作为AML疾病潜在标志物在不久的将来有望应用于临床，为发展AML新的诊疗技术作贡献。

2.2 EVs与AML化疗耐药 AML一线治疗的完全缓解率在年轻人中为60%～80%，在老年人中为40%～60%；但近60%的老年患者因复发导致诱导化疗失败，其中>85%的患者治疗失败，而耐药是治疗失败的关键因素。AML细胞本身释放的EVs，能通过诱导凋亡抵抗引起化疗耐药[23]；Viola等[27]研究表明，AML骨髓基质细胞EVs含量的变化与酪氨酸激酶抑制剂耐药性的增加相一致，而进一步研究表明骨髓基质细胞能够通过EVs分泌FGF2来调节AML细胞对酪氨酸激酶抑制剂的化疗抵抗[28]；而且，AML源性外泌体的VEGF/VEGFR能够诱导HUVECs糖酵解，导致血管重构和获得化疗耐药性[7]。此外，Bouvy等[29]研究表明，耐药的AML细胞能够通过EVs核酸和携带的多药耐药蛋白1转移其耐药性。

综上所述，EVs是现代研究中新兴领域之一，其参与机体细胞间信息传递，与疾病发生发展密切相关。大量研究数据表明，白血病细胞来源的EVs在AML凝血异常、疾病进展、疾病潜在标志物及化疗耐药等方面均发挥重要作用。未来的研究必定会加深我们对AML中EVs与疾病相互作用的理解，可能发现白血病潜的新靶点，从而为AML的诊断、治疗、预后评估及疾病监测开辟新的方法。