微生物次级代谢产物生物合成的研究进展

赵江华 房欢 张大伟

（1.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；2.河北农业大学食品科技学院，保定071000）

微生物包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。其涵盖了有益和有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保和体育等诸多领域。在我国教科书中，将微生物划分为以下8大类：细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体和螺旋体。在上述8类微生物中，能够产生与我们生活息息相关的次级代谢产物的主要是细菌、真菌和放线菌。

生物从环境中摄取小分子营养物质，合成氨基酸、蛋白质、核酸等生命活动必须的物质以及获取能量的过程称为初级代谢［1］。除了初级代谢外，微生物还能通过次级代谢活动分泌多种次级代谢产物，如维生素等具有重要价值的活性物质。不同于初级代谢，次级代谢通常由营养物质、生长速度、反馈控制、酶失活和诱导等因素控制，并非生命体必须进行的活动。但两者并不是毫无联系，它们之间互相作用，共同调节生命活动。初级代谢是生命活动的基础，其产物可作为次级代谢的原料，次级代谢产物如抗生素能够抑制其他微生物的生长，所以次级代谢能够调节初级代谢活动［2］。常见的次级代谢产物有抗生素、激素、毒素、生物碱及维生素等［3］。

1 次级代谢产物的来源

1.1 细菌来源次级代谢产物

除了植物，细菌占了地球上生物量的大部分。它们随处可见，尽管某些物种只在特定的生态位中繁衍生息［4］。长期以来，细菌发酵一直被用于制造具有营养、农化和医药价值的天然产品。如黏细菌，它产生的次级代谢产物无论是在化学结构还是生物活性上都具有丰富的多样性。代谢产物的多样性及广谱活性，在开发药物方面具有巨大的潜力。黏细菌的抗生素产生菌的比例高于目前已知的产生抗生素最多的放线菌［5］。

1.2 真菌来源次级代谢产物

真菌具有生物多样性，已描述的真菌种类约 9.7万余种，仅占 6%左右。现今已知的具有生物活性的微生物次级代谢产物中，有50%是丝状真菌产生的［6］。包括人们最熟悉的青霉素和头孢菌素等抗生素、免疫抑制剂环孢菌素A、降血糖药物阿卡波糖以及降血脂药物洛伐他汀等。此外，真菌还能够产生大量的细胞毒物质，其中包括一些强毒性化合物，如单端多孢霉烯以及黄曲霉毒素等真菌毒素［7］。众所周知，黄曲霉毒素能够致癌，严重威胁人类的生命健康，但是人类可以通过研究其致癌机理，发现潜在的抗肿瘤药物。如具细胞毒活性的二酮哌嗪类化合物可作为治疗肿瘤的药物［8］。

1.3 放线菌来源次级代谢产物

微生物产生的具有生物活性的天然次级代谢产物，大都基于对放线菌的挖掘。放线菌次级代谢产物种类丰富，约占已报道微生物来源生物活性物质的50% 左右，这些物质根据化学结构可分为 β-内酰胺类、多肽类、糖肽类、核苷类及聚酮类等［9］，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、杀虫及免疫抑制剂和免疫激活剂等的功效，在医药业、农业、兽业、食品工业等领域有广泛地应用［10］。

虽然对次级代谢产物的产生菌已经进行了多方面的挖掘，但迄今为止我们发现的数量只是冰山一角，况且利用传统的办法已经很难发现新的产物，在提高产物产量方面也遇到了瓶颈。有两个因素阻碍了新化合物面世：（1）能够在人工培养条件下存活的微生物为数不多，目前在实验室培养条件下成功的仅占0.1%-1%［11］；（2）在普通培养条件下，大多数次级代谢产物生物合成基因簇（BGCs）不能表达。如果这些潜在的生物合成开关被打开，就有望发现更多新的活性产物，新药研发会有一个跳跃式发展［12］。

2 研究微生物次级代谢产物应用到的方法策略

2.1 次级代谢产物生物合成基因簇异源表达

阻碍次级代谢产物出现的因素之一就是标准实验室生长条件，因此微生物代谢组尚有很大的开发空间［13］。2018年，Harvey等［14］开发了异源表达合成生物学平台，用于酿酒酵母中真菌生物合成基因及其编码代谢物的快速、可扩展表达。通过高通量基因组测序，对潜在的次级代谢产物合成途径有了一定认识。通过异源表达途径重建与基因工程相结合，可以发现新的化合物，阐明产物合成途径，优化产品产量。大肠杆菌、酵母菌、丝状真菌作为模式菌株，有完善的遗传工具箱，是高效的异源宿主［15］。在Harvey等［14］的研究中，将41个不同来源的BGC在酿酒酵母中表达，其中22个（54%）来自不同的子囊菌和担子菌，产生了可检测的非酿酒酵母特有的化合物。这个平台使酵母的异源表达方法向前迈进了一大步，并可能为发现许多天然产物打开大门。通过异源表达，可以更清楚的了解产物的代谢过程，为产物产量的优化和获取更加有价值的次级代谢产物指明了方向［16］，其优点主要包括：（1）绕过了难以培养或无法培养的菌株；（2）将每种BGCs与其产生的次级代谢产物挂钩；（3）有利于对宿主进行基因操作、优化后期的发酵条件，实现工业化生产［17］。

2.1.1 宿主细胞遗传修饰和改造 异源沉默基因簇表达时，为防止宿主环境不适合外源基因的表达，有必要对宿主进行遗传修饰改造［18］。和公司裁员大概是一个道理，对基因组进行删减，就像是给细胞减负，这样才能达到特定次级代谢产物的生物合成水平。本身的基因对外源基因簇的影响降低，可为沉默基因簇的表达提供理想条件［19］。当大肠杆菌或酵母用作真核生物次级代谢产物生物合成基因的表达宿主时，为防止宿主元件的缺失，需要对宿主菌株进行工程设计，以产生 4-磷酸泛乙烯基转移酶（PPTase），特别是 PKSs 和 NRPSs 的表达。丝状真菌宿主具有内源性 PPTase 活性，为PKSs 和NRPSs的ACP和PCP结构域提供修复基，因此它们不需要外源性PPTase基因［15］。

2.1.2 对基因簇的加倍和其他调控 在对卡那霉素高产菌株的研究中，工作人员发现多拷贝的卡那霉素基因簇，这种多拷贝的方法是提高产量的有效手段［20］。除了基因簇加倍，还可以采取转座子干扰、紫外线或化学诱变或单基因缺失文库的手段，用BGC删除策略构建基因缺失文库，然后研究这个敲除文库中的代谢图谱。还有敲除抑制次级代谢产物表达的基因、过度表达簇特异性转录激活因子或全局性调控因子［15］、组成型表达或过表达同源正调控基因［21］等这些途径都有助于发现更隐秘或沉默的次级代谢物。

2.1.3 宿主细胞与生物合成基因簇适配性改造 丝状真菌的异源表达具有一定的挑战性，寄主可能受到插入簇的影响，导致代谢物谱发生变化，或插入簇与原簇之间产生串扰，从而难以识别正确的新次级代谢产物。为了使异源簇表达，通常将内源次级代谢产物BGCs沉默，或将其敲除或抑制其表达。但是，这一举措会使异源簇与宿主不适配的问题更突出，通常不能产生理想的产物或产量很低。主要原因是基因簇未正常转录，直接过表达关键基因、更换活性适当的启动子，可精细调控关键基因转录量使基因簇正常表达。也可引入供体基因增加前体。此外，异源表达过程中有时不会正确利用底物，引起资源浪费，限制合成能力，导致产量降低。引入纠错因子可以阻断宿主细胞中的某些基因编码酶对异源次级代谢产物的错误修饰，可使产物复性［22］。

2.2 转录、翻译水平进行调控

2.2.1 核糖体工程 野生型变铅青链霉菌在正常情况下不会生产抗生素，但是当环境因素改变导致其核糖体蛋白S12突变后，便能生产大量蓝色的放线紫红素［23］。通过调节核糖体蛋白或rRNA可以显著改变细菌基因表达，最终导致不活跃（沉默）基因的激活。因此，我们的最终目的是开发“核糖体工程”，以合理的方法充分激发细菌的能力。Ochi研究组［24］引出了核糖体工程的概念：微生物在资源耗尽时会产生突变，形成耐药性菌株。该菌株核糖体或RNA聚合酶改变，会影响蛋白的表达，最终的影响是出现新的代谢产物或者原有代谢物的分泌量提高。核糖体和 RNA 聚合酶是蛋白质合成过程中的两个重要部分，如果它们发生了突变将会对次生代谢物的合成带来深刻的影响［25］。刘华华等［26］通过核糖体工程技术成功筛选获得一株耐链霉素的阿维拉霉素高产突变菌株S.viridochromogenes gs 77-54，而且对其遗传稳定性能进行测验，结果表现出很好地稳定性。

2.2.2 干扰蛋白质降解系统 催化反应的蛋白包括一些转录因子不能持续发挥作用，它们都会经蛋白酶途径失活，这一过程依赖泛素标记的靶蛋白，需要多蛋白COP9信号复合物。Jennifer等［27］将构巢曲霉作为研究对象，敲除编码COP9第5亚基的csnE基因，对突变体的次级代谢产物进行了研究。研究结果显示：有聚酮合成酶的基因被激活并且产生了它的代谢产物DHMBA，除此之外还从突变菌株中发现了苔色酸。实验表明，敲除蛋白失活过程中编码关键蛋白的基因可以阻断代谢过程中蛋白质的降解，可以激活沉默的基因表达。通过他们的实验可以预见，还有更多新的沉默基因以及次级代谢产物有待发现［28］。

2.2.3 转录因子的调控 链霉菌产生气生菌丝体和次级代谢产物的过程由微妙而精确的监管系统控制。与真菌一样，细菌代谢过程中最常见的是在转录起始水平的调节，在这一过程中，起主要作用的是转录因子，它们通过结合DNA上特殊的序列来抑制或激活特定基因的转录［29］。转录因子对基因转录的起始进行调控，按照调控作用划分，转录因子可分为正调控因子和负调控因子。正调控因子对基因簇的转录起到促进作用，而负调控因子是相关基因簇的“绊脚石”，使基因簇关闭［30］。为了研究 HOS2型酶在曲霉中的作用，Angelo等［31］删除了 HosA 的编码序列。将具有缺失结构的单一基因组整合的hosA缺失菌株的孢子接种到琼脂平板上，并将分别装载有浓度增加的抗真菌物质的条带施加到平板上。结果显示，HosA 缺失菌株在琼脂平板上和液体培养中有显著的色素沉着，表明 HosA 可能作为次级代谢产物的阻遏物。为了证明 HosA 在 烯酸（OA）生物合成基因簇调控中的作用，研究人员将 HosA 缺失株培养 24、36、48 和 60 h，用 RNA 杂交探针对烯酸生物合成基因簇聚酮合酶基因 orsA 进行 Northern杂交分析。结果表明HosA 活性抑制烯酸生物合成。但是，与烯酸相比，hosA 缺失对 青霉素（PN）产生显著而相反的结果。因此，转录调控因子也是一种常用的抑制或激活次级代谢产物的策略。

2.3 表观遗传调控

在DNA 序列不变的情况下改变基因表达或使其沉默，这种策略称表观遗传调控。由于真核生物具有染色体结构，染色质缠绕而导致生物合成基因簇处于沉默状态，通过打开染色体的螺旋结构，使染色质处于“蓬松”状态，进而解除生物合成基因簇的“沉默禁令”。LaeA就通过染色体重塑解除沉默禁令的信号。LaeA携带S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）结合域，SAM结构域识别甲基转移酶的特征，将甲基从普遍存在的SAM转移到氮原子、氧原子或碳原子。这种反应经常用于所有门的生物体中，不仅修饰蛋白质，还修饰DNA、RNA和小分子。作为一种全局性调控因子，LaeA广泛存在于丝状真菌中。除了采用分子遗传学手段控制LaeA的表达，目前经常使用抑制剂抑制表观遗传修饰酶的表达［32］。Willams等［33］利用化学表观遗传学方法，在枝孢菌的培养中加入5-氮胞苷，进而得到氧化脂质。Henrikson 等［34］在黑曲霉的发酵过程中添加脱乙酰酶抑制剂SAHA，意外获得了新的化合物 nygerone A。对黑曲霉进行研究发现，36%的黑曲霉BGCs的转录被脱乙酰酶抑制剂SAHA显著上调，说明染色质重塑在激活沉默基因簇中的潜力［35］。

2.4 代谢调控技术

代谢调控就是通过对DNA进行有目的改造，对体内的代谢网络进行精密调控，实现菌体性能的提高、其他大分子装配等的过程。为提高链霉菌中聚酮类化合物的效价，研究人员设计了一个动态降解三酰甘油（ddTAG）的策略，来高效利用三酰甘油以增加聚酮的生物合成。将sco6196基因置于cumate诱导启动子的控制下，以生成ddTAG模块，从而能够选择性地控制TAG降解的时间和强度。将ddTAG质粒转化到M145以产生菌株M145-DT，发现使用诱导剂调节TAG降解可增加放线菌素的效价。对这一现象的合理解释是TAG的合理流通可以提供并将更多的碳通量转向放线菌素合成。ddTAG的应用使阿维菌素B1a在工业规模发酵中的效价提高了50%，达到9.31 g/L［36］。在链霉菌中，脂肪酸和聚酮类化合物的合成共用前体乙酰CoA，因此会发生底物的竞争。有研究表明，在链霉菌中有两种中心碳代谢酶通过复制被扩增，它们分别是磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，并且对着两种酶进行详细的遗传和生化分析，发现这两种酶的缺失突变体表现出抗生素生产过剩的表型。这表明初级代谢的精细平衡受到干扰会影响前体的供应和应激反应。因此，通过代谢干扰可增强主要代谢底物的供应，脂肪酸生物合成的抑制被作为一种促进聚酮类次级代谢产物合成的途径［37］。上述两个例子，都是通过调控代谢过程，改变了碳的流通，将碳源集中分配，在保证不破坏其他关键途径的前提下，以提高目标产物产量为最终目标。

2.5 调整培养条件

微生物易受培养条件的影响，如培养基组成、温度、pH 值、金属离子、氧气浓度、盐度、培养状态、生物合成前体等，这些因素的调整必定会引起酶活性的改变，可能导致与之相关的次级代谢物多样性的改变。因此在微生物赖以生存的培养基上进行研究，就能产生新类型的次级代谢产物的出现或者已知次级代谢产物产量增加的结果。一株海洋衍生菌株 Ascotricha sp.ZJ-M-5 在由海盐组成的富营养化培养基中培养时，发现产生了一种新的三萜类化合物（119）和一种新的环烯醚衍生物（120）。然而，在改良的 Czapek-Dox 培养基中检测到3种新的石竹烯衍生物（121-123），而在没有 Mg2+的发酵液中没有化合物122［38］。这种方法相对经济简单但结果却有多种可能，起到的是“牵一发动全身”的作用，不能确定因某一条件的改变引起的基因簇的变化，盲目性强。因此对后面比较分析代谢谱造成困难，对基因组信息有缺漏或没有测序的次生代谢产物的发现有帮助。低浓度抗生素、信号分子的添加［39］也是从这种方法中衍生出来的。

2.6 微生物共培养

在一种培养基中，一个菌株与另一个菌株之间的关系可能是竞争性的、对抗性的或友好的。两个或两个以上菌株的共培养通常对提高已知化合物的产量或积累在无菌培养中未检测到的隐匿化合物具有积极作用。土壤放线菌 S.coelicolor 与珊瑚球菌共培养时，可显著提高红色化合物十一肽的产量。一株陆地细菌Tsukamurella pulmonis TP-B0596 与一株链霉菌 NZ-6 共培养，刺激了3种前所未有的双环和三环大内酰胺的新代谢物的产生。两种海绵源放线菌Nocardiopsis sp.RV163和放线菌EG49 的共培养，诱导了10种化合物，包括二酮哌嗪、安古霉素和β-卡波林衍生物，而在单一培养中仅分离出3种天然产物。一种真菌菌株土曲霉与铜绿假单胞菌共培养时，可产生两种新的莽草酸类似物和4种新的丁烯内酯衍生物，而这些化合物均未在无菌培养基中被发现［38］。微生物为了有限的资源，如空间或营养物而相互竞争。某些细菌可产生对其他微生物有毒的分子，使自己具有竞争优势。这些有毒分子通常被称为抗生素，然而，一些细菌可利用抗生素作为化学信号来调节它们的活动进而产生其他类型的产物［40］。虽然这种方法有效，但是同OSMAC策略一样也具有一定的盲目性，两株菌相互作用，其应激反应产生的物质作用在彼此身上并且体现在最后的产物上，我们不能摸清楚是哪种分子发挥作用。

3 结语

微生物次级代谢产物在农业、食品和医疗等领域有着广泛的应用，具有很大的商业价值，因此提高次级代谢产物的产量将会创造巨大的经济价值，挖掘新的次级代谢产物也会对新药的开发起到极大的推动作用。生物学的发展，既丰富了我们的理论依据，也为我们带来了新技术和新工具，微生物基因组测序和相关的生物信息工具的发展让我们看到了挖掘新的次级代谢产物的前景。若这些沉默的基因簇全部被激活，次级代谢产物的数量将会以指数形式进行增长。上述挖掘新的次级代谢产物、提高微生物次级代谢产物的产量的策略中，归根结底都是为了激活沉默的微生物次级代谢产物BGCs。只不过有的方法起到的是全域性调节，有的方法是针对具体的基因进行调控。近来，代谢组学迅速发展，我们对微生物体内的代谢网络认识的越来越清楚。了解从初级代谢到次级代谢的转变可以帮助制定策略，通过调控代谢过程使资源更多、更集中的流向目标产物。未来可以将传统的代谢工程技术与更复杂的合成代谢工程相结合，运用系统生物学和进化工程可极大地促进所需和有价值的代谢物的产生。基因组测序和DNA合成成本的降低，以及用于BGCs克隆和重构的许多有效遗传工具出现，基因编辑技术迅速崛起，CRISPR-Cas9系统正在成为一个新兴的基因组编辑平台，结合生物信息学、合成生物学、代谢组学等技术，通过对细胞内代谢网络的深刻认识，相信微生物次级代谢产物BGCs的挖掘在后基因组时期将会进入一个黄金时代。