基于代谢组学的转基因水稻生物安全评价方法研究

兰青阔 赵新 沈晓玲 魏静娜 刘双 陈锐 檀建新 王永

（1.天津市农业科学院，天津 300381；2.河北农业大学，保定 071001）

截止到2018年，全球共有26个国家种植了1.917亿公顷转基因作物［1］。伴随转基因技术的发展和人们生活水平的提高，转基因作物及其衍生食品的安全问题受到社会强烈关注和争议［2-3］。世界各个国家、组织和地区，都对转基因作物的研发和应用规定了明确的政策和法规［2，4］，对其开展严格的生物安全评价。

转基因生物安全评价是基于对转基因产品和同类非转基因产品的详细比较分析。1993年，经济合作与发展组织（OECD）提出“实质等同性原则”作为转基因食品安全性评价的基本原则［5］。在比较分析中，对象的选择是整个安全评价过程中的关键。最初采用的评估方法是靶标性地检测某一种或一类成分的差异；对象通常包括主要成分、次要成分、有毒物质、必需营养物质、抗营养因子（胰蛋自酶抑制剂）等［6-7］。近些年，多位研究人员提出当前的靶标分析方法过于具体，容易漏检非预期效应［8-10］，应该补充采用更加全面无偏向性的、非靶标轮廓分析的组学分析技术，包括转录组学［11］、蛋白质组学［12］和代谢组学技术［10-11］。这些组学技术能够更好的挖掘转基因作物与非转基因受体之间差异的范围和来源，发现非预期效应［13］。

代谢组学（Metabonomics或Metabolomics）属于全局系统生物学研究方法，其分析靶标是细胞中相对分子质量在1 000 Da以内的小分子代谢物［14-15］。本研究以转基因抗虫水稻及其非转基因受体为研究对象，采用基于UPLC-Q/TOF MS分析的转基因作物代谢组评价技术流程，对代谢组提取方法、数据处理方法、数据分析软件等技术进行了探索。本研究丰富了现有的转基因生物安全评价的内容和方法，为转基因生物安全评价与管理提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

转基因抗虫水稻及其非转基因受体水稻种子由本试验室保存。转基因抗虫水稻含有P-Ubi、Cry1Ab、T-35S、T-nos等4个外源元件，单拷贝形式插入在水稻染色体中。

1.2 方法

1.2.1 水稻萌发与培养 将种子均匀铺在培养皿中，放入光照培养箱（GXZ-450A，宁波江南，条件为16 h光培养，光强80 mE·s-1·m-1，温度28℃；8 h暗培养，温度为22℃）；7 d后移至营养土中（16 h光培养，光强80 mE·s-1·m-1，温度32℃；8 h暗培养，温度为28℃）。转基因及其受体样本的生长环境包括营养基质、温度、湿度和光照时间等均相同。

1.2.2 代谢组提取方法 取适量水稻叶片组织于2 mL预先放入钢珠的离心管中，液氮中处理1 min，用冷冻研磨仪（MM400，德国莱驰）研磨成粉末；称取100 mg粉碎样品于新的2 mL的离心管中，加入提取溶剂（不同浓度的甲醇水溶液）1 mL，涡旋混匀，置于高速冷冻离心机（CR22GIII，日本日立）中，4℃ 下16 000 ×g离心15 min；上清液即为样品提取液。转基因及其受体各7株平行。

1.2.3 代谢组分析 本研究应用的液质平台为ACQUITY UPLC H -CLASS串联Xevo G2-XS Q/TOF质谱。

1.2.3.1 液相色谱条件 色谱柱为 BEH C18（1.7 μm，2.1×50 mm）；流动相采用乙腈-水-甲酸系统，其中（A）0.1%（V/V）甲酸超纯水，（B）乙腈，优化以后的梯度洗脱程序见表1；柱温40℃，流速为0.40 mL/min；进样量2 μL；进样后洗针6 s；单个样品运行时间18 min；样品室温度为4℃。

表1 UPLC流动相洗脱梯度

1.2.3.2 质谱条件 采用正、负两种模式测定。

正离子模式：毛细管电压（Capillary Voltage）1.5 kV；锥孔电压（Sampling Cone Voltage）40 V；Source offient 80；离子源温度（Source Temperature）120℃；脱溶剂气温度（Desolvation Temperature）400℃；扫描时间（Scan time）0.2 s；进样锥孔气体流量（Cone Gas Flow）50L/h；脱溶剂气流速（Desolvation Gas Flow）800 L/h；质量数检测范围（Mass range）100-1 200 Da；实时质量校正（Lockmass）标准品为亮氨酸脑啡肽醋酸盐（LE，［M+H］+=556.277 1，［M-H］-= 554.261 5）。

负离子模式：毛细管电压（Capillary Voltage）1 kV；锥孔电压（Sampling Cone Voltage）40 V；Source offient 80；离子源温度（Source Temperature）120℃；脱溶剂气温度（Desolvation Temperature）450℃；扫描时间（Scan time）0.2 s；进样锥孔气体流量（Cone Gas Flow）50 L/h；脱溶剂气流速（Desolvation Gas Flow）800 L/h；质量数检测范围（Mass range）50-1 200 Da；实时质量校正（Lockmass）标准品为亮氨酸脑啡肽醋酸盐（LE，［M+H］+=556.277 1，［M-H］-= 554.261 5）。

1.2.3.3 代谢组学方法学考察 同一份样品分别在放置0 h、5 h、10 h、20 h、30 h、40 h之后进行检测，比较保留时间和峰面积的RSD，考察提取方法的稳定性；同一份样品连续进样5次，比较色谱峰保留时间的一致性，考察方法的精密度；相同条件下提取7株转基因抗虫水稻的叶片并进行代谢组检测，比较色谱峰相对保留时间的一致性；考察方法的重复性。

1.2.4 数据处理 首先使用MarkerLynx4.1软件（Waters公司）对色谱图进行初步分析处理，提取化合物的质量数、相对保留时间、峰强度和峰面积，导出数据；应用软件Progenesis QI（Waters）和基于R语言的开源软件MAIT［16］（Metabolite Automatic Identification Toolkit）进行数据处理和代谢组差异化分组分析。

Progenesis QI软件的主要参数：加和离子选择M+H，M+NH4，M+Na，M+K；抗虫转基因水稻样本为一组，非转基因受体样本为一组；分析时间为0-18 min；质量数范围为50-1 000 Da；软件分析后，得到Score图和Loading图，选择Loading图中偏离远点的点进行Transfer Loadings data，其中Anova P-value≤0.05，Max fold change≥2的化合物为差异代谢物［17-18］。

2 结果

2.1 水稻叶片代谢组提取方法优化

以水稻苗期叶片为试验对象，比较不同浓度的提取溶剂（100%甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）对水稻代谢物提取的效果。结果（图1）显示，随着甲醇浓度的增加，BPI谱图中峰个数增多；在甲醇浓度为80%和100%时，峰个数基本保持一致，BPI谱图中峰的数目较多，可覆盖更多代谢物，提取效果较好。考虑到溶剂效应，流动相中含有一定比例的水更好，因此选择80%甲醇浓度开展后续试验。

图1 不同浓度提取溶剂下BPI图

2.2 代谢组分析方法考察

对优化的代谢组分析方法的稳定性、精密度和重复性进行了考察。同一份样品提取液分别放置0 h、5 h、10 h、20 h、30 h、40 h之后，进行UPLCQTOF分析，其相对保留时间的RSD＜5%，主要共有峰面积的RSD≤7%，说明样品提取溶液至少在40 h内基本保持稳定；精密度考察中，同一份样品连续进样5次，其色谱峰相对保留时间的RSD＜2%，表明方法精密度良好；重复性考察中，同一类型样品、不同次数提取，其色谱峰相对保留时间的RSD＜2%，表明方法重复性良好。

2.3 数据分析方法优化

将苗期样本按阳性（转基因）和阴性（非转基因）分成两组，经UPLC-Q/TOF-MS上机后得到代谢组数据。将得到的代谢组数据进行PCA分析，正、负两种离子采集模式下得到Score图（图2）。在正离子模式下，阳性和阴性组间距离较近，同组样品距离较远，且分布比较离散，两组样品没有完全区分，分组效果不明显，说明样本之间存在微量差异，但分析获得的差异不大。负离子模式下，阳性和阴性两组样品之间相互交错，组间比较离散，没有达到分组效果。因此，由PCA分析得到的结论是两组样本差异不太明显，没有完全区分开来。

图2 转基因水稻及其受体苗期叶片的PCA分析图

采用OPLS-DA分析模式对苗期的两组样本进行数据处理，得到Score图（图3）。在正离子模式下，阳性和阴性两组样品之间没有出现交叉和重叠，且同组之间距离较近，组内样品个体之间离散程度较小，达到很好的分组效果；在负离子采集模式下，两组样本虽然能够区分开来，但是组间样本离散程度较大，效果没有阳离子模式好。说明OPLS-DA分析模式在两组样品间的区别能力比PCA分析模式较好，且在正离子采集模式下分组效果更好。

图3 转基因水稻及其受体苗期叶片的OPLS-DA分析图

2.4 代谢组差异分析

应用Progenesis QI软件进行分析，正离子模式下共检测到6 459个化合物，负离子模式下共检测到6 783个化合物。选择VIP图中≥1的点，根据P≤0.05、Max fold change≥2条件进行筛选，共筛选出49个差异性位点。导出所有代谢物Normal Abundance Profile图（图4），发现在正离子模式下，差异较明显的是14.99 _782.5849 m/z代谢物，在同组样本中分布不太均匀，总体上在阳性组的含量比阴性组较高；在负离子模式下，差异较明显的是4.73_7491.1927 m/z代谢物。

应用基于R语言的软件包MAIT对代谢组数据进行数据处理。该软件的分析步骤包括peak detection、peak annotation、statistical analysis，具 备PCA、OPLS-DA、SVM、KNN等预测、统计分析功能。对苗期样本进行、代谢组差异筛选、差异代谢物进行相关性分组（图5）和欧式距离分组（图6）分析。结果表明，随着P值减小，阳性和阴性分组越明显，也越能获得差异较大、数据更稳定的代谢物。

图4 49个差异代谢物在两组样本中的分布情况

图5 转基因抗虫水稻苗期叶片代谢物相关性分析

图6 转基因抗虫水稻苗期叶片代谢物欧氏距离分析

通过相关性分组（图5）和欧式距离分组（图6），均获得差异代谢物为21 597、21 401、3 221、11 767、9 152、23 412。其含量详细信息见图7。

图7 差异代谢物在两组样本中的分布情况

3 讨论

3.1 基于代谢组学的转基因生物安全评价实验设计

转基因生物安全评价是转基因生物安全管理的重要支撑，包括分子特征分析、环境安全评价和食用安全评价。基于非靶向性的代谢组学分析，是对现有安全评价方法体系的完善和补充。在开展转基因食用安全评价和环境安全评价的同时，开展代谢组生物安全评价，是一个较为合理的解决方案。食用安全和环境安全实验中，环境和条件均控制在相对精准的条件下，技术方案设置了不同的处理水平（饲喂、接虫、干旱等）和对照材料，可以在对实验材料进行常规靶向性分析的同时，开展非靶向性的代谢组分析。Mesnage等［19］结合大鼠喂养试验，以大鼠的肝脏和肾脏为检测对象，开展转录组学和代谢组学分析，以观测转基因玉米可能的生理毒性。Peng等［18］以转cry和epsps基因水稻灌浆期（开花后14 d和35 d）籽粒为检测对象，为了解转基因水稻与非转基因受体在种子发育阶段的代谢变化提供信息。

3.2 代谢组学分析平台

本研究的目标为建立一套完整的转基因水稻代谢组生物安全评价技术流程，包括外界胁迫处理、取样节点和组织、样品前处理、样品代谢组分析、数据处理、代谢途径和非预期效应分析等步骤。在代谢组分析过程中，常用的代谢组学分析技术有核磁共振（NMR）［20］、气质联用（GC-MS）［21-22］、液质联用（LC-MS）［23］、傅里叶变换红外光谱与质谱联用（FT-ICR MS）［24］、毛细管电泳质谱联用（CEMS）［25］等。近几年出现的超高效液相色谱（UPLC）技术大大提高了分离速度，其与四级杆飞行时间质谱（Q/TOF）联用组成超高效液相色谱-飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF/MS），已广泛应用于作物代谢组学研究［18，26］。Wang等［11］以从我国不同省份收集的复合性状转基因玉米12-5×IE034、12-5、IE034和常规品种为研究对象，应用UPLC-MS平台对代谢组进行分析，发现与亲本12-5和IE034相比，杂交品种12-5×IE034分别有15和112个不同的代谢物，其差异小于其他玉米品种之间的差异；Peng等［18］应用UHPLC-QTOF-MS分析平台，在籽粒灌浆期和成熟期分别鉴定出161和138个差异代谢物。

4 结论

本研究以转基因抗虫水稻及其非转基因受体为研究对象，建立了包括样品培养、代谢物提取、UPLC-QTOF/MS分析、数据处理等步骤的转基因作物代谢组评价技术流程，并对代谢组提取方法、数据处理方法、数据分析平台等进行了优化评估。结果表明，应用80%甲醇水能有效提取水稻苗期叶片中的代谢物；经UPLC分离、QTOF/MS分析、正交校正的偏最小二乘辨别分（OPLS-DA）等计算方法，能够有效发现转基因水稻及其受体之间的差异代谢物。