基因编辑技术在作物育种中的应用与展望

李树磊 郑红艳 王磊

（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

随着全球人口数量增加、气候变化、土壤流失和水资源缺失等问题日益突出，到2050年，全球对粮食的需求预计将比2005年增加100%-110%［1］。为满足人们对农作物产品日益增长的需求，作物育种技术创新显得尤为重要。杂交育种、突变育种和转基因育种是目前现代农业中作物改良的主要方法，然而杂交育种需要年限较长［2］，突变育种的随机性较大［3］，转基因技术可通过引入外源基因从而获得优良性状，但其商业化与监管过程比较繁琐［4］。基因编辑技术近年来发展迅速，通过不断地改进，该技术现已成为一种操作简单、快速高效、成本低的靶向编辑基因工具，运用基因编辑技术可以对作物自身基因进行精确删除或者插入以培育新品种，具有巨大的发展潜力和应用前景。本文描述了3种基因编辑技术的原理，并对CRISPR/Cas系统的功能、局限性以及其在作物育种上的应用做出详细总结，最后对基因编辑作物的未来进行展望，旨在为该技术在作物育种上的应用提供借鉴和新思路。

1 基因编辑技术的发展

目前成熟应用的基因组编辑技术主要有3种，按时间顺序依次为：人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术（Zinc finger nucleases，ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶技术（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和RNA介导的CRISPR/Cas技术（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas），以下主要对3种技术的组成和作用原理做简要介绍。

1.1 锌指核酸酶技术（ZFNs）

锌指核酸酶（ZFNs）具有单独的DNA结合域和DNA裂解域，即锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）与天然IIS型限制酶Fok I，且已被广泛应用于靶向基因研究［5］。ZFNs诱导的双链断裂受到细胞DNA修复过程的影响，从而导致靶向突变和靶向基因置换的频率都非常高。

锌指蛋白是一类通过Cys2-His2锌指结构域去结合DNA的转录因子。其中该结构域每30个氨基酸结合一个锌原子，该转录因子是由一个α螺旋和两个反向的β平行形成紧密的β-β-α结构，能特异性识别3个连续的碱基对，ZFNs可以通过设计锌指结构域以及多个锌指蛋白来实现对特异的基因进行编辑［6-9］。天然IIs型限制酶Fok I具有物理上可分离的结合和裂解活性，其中裂解域没有明显的序列特异性，且Fok I核酸酶需要形成二聚体才可切割DNA产生双链断裂（double strand breaks，DSBs）［10-11］。

该技术靶向结合效率高，但由于蛋白设计复杂且筛选过程很漫长，且该技术无法实现对任意靶基因的结合与高通量编辑基因，所以该方法仍在不断完善中。

1.2 转录激活物效应核酸酶技术（TALENs）

转录激活子样效应核酸酶（TALENs）技术是继ZFNs之后的一种高效靶向基因编辑新技术，类似于ZFNs，TALENs包含一个识别特异DNA序列的TALEs（Transcription-activator-like effectors，TALEs）蛋白和非特异性的Fok I核酸酶，由两个TALEs蛋白识别和结合DNA靶位点，同时Fok I核酸酶对靶DNA进行切割，造成DNA双链断裂从而实现对基因组靶位点的编辑［12］。

用于设计TALEs蛋白的基本结构域是一个高度保守的重复结构域，TALEs蛋白的DNA结合域由33-35个氨基酸的重复单元组成，其中位于12和13位的两个可变氨基酸残基称为重复可变的双氨基酸残基（Repeat variable di-residue，RVD），通过这两个氨基酸残基识别并结合DNA序列［13］。

TALENs的裂解DNA的能力几乎与ZFNs的相同，且设计更为简单，特异性较强。但TALEs蛋白的同源重复序列较多，组装的工作量较大。且TALEs蛋白的体积几乎是ZFPs的3-4倍，对转化手段具有一定的限制，同样也限制该技术在高通量编辑上的应用［14］。

1.3 规律成簇的间隔短回文重复相关蛋白技术（CRISPR/Cas）

CRISPR/Cas系统是在细菌和古细菌中存在的一种适应性免疫反应，其主要作用为抵御噬菌体病毒和外源质粒DNA的入侵。

目前有3种CRISPR系统被验证，分别是TypeⅠ型基因（特征基因Cas3）、TypeⅡ型（特征基因Cas9）和TypeⅢ型（特征基因Cas10），每一种系统都使用一组独特的Cas蛋白和crRNA进行CRISPR干扰。其中I型和III型系统利用大型复合Cas蛋白质与复杂的crRNA结合去编辑目标序列［15］，而II型CRISPR系统只需依赖1个Cas9核酸酶及2个RNA，即crRNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和tracrRNA（trans-activating RNA，tracrRNA），就可以造成基因的双链断裂［16］。

基于以上CRISPR/Cas9系统的优良特性，该系统现已逐步改良为一个由RNA引导靶向编辑DNA的平台，广泛用于基因编辑、转录干扰和表观遗传调节等方面。在实际应用中，CRISPR/Cas9系统通常包含一个Cas9蛋白和一段根据靶位点设计的大约100 nt的sgRNA（simple guide RNA，sgRNA）序列，Cas9核酸酶在gRNA的引导下对DNA特定位点进行切割产生的DNA双链断裂。而DNA的双链断裂可以通过非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（Homology recombination，HR）两种方式进行修复，从而实现目的性编辑。

尽管运用ZFNs和TALENs技术已经在多种动物及植物中成功实现了基因的定点编辑，但这两种技术定向打靶依赖于特异性结合蛋白的合成，操作起来繁琐费时且打靶效率低，致使其应用进展缓慢，而CRISPR/Cas技术具备操作简单、周期短、效率高等优点，已经得到广泛应用和迅速发展，因此本文主要对CRISPR/Cas技术的作用方式及其在作物育种中的应用进行综述，为农作物品种改良提供有益的参考。

2 CRISPR/Cas的应用

CRISPR/Cas系统主要是通过sgRNA与Cas蛋白起作用，而通过修饰以上两部分，CRISPR/Cas系统的应用将被不断拓宽。

2.1 靶向基因敲除（Knock-out）及敲入（Knock-in）

Cas9在gRNA的引导下，识别靶序列的PAM（protospacer adjacent motif，PAM）位点并切割靶位点，DNA断裂引起的修复主要以NHEJ的方式修复。但NHEJ是一种易出错的修复方式，会在双链断裂的位置引入小的核酸插入或缺失（Insertion and deletion，indel），导致靶基因蛋白翻译产生移码突变，从而破坏基因功能。如果细胞中有与靶位点序列同源的DNA供体（DNA donor）片段时，位于供体DNA上的基因片段会通过同源重组方式整合到双链断裂的位置，从而实现目的片段敲入/替换［17］。

2.2 单碱基编辑

现在已经出现两类DNA碱基编辑器，胞嘧啶碱基编辑器（Cytidine base editing，CBE）将C·G碱基对转换为T·A碱基对，腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editing，ABE）将A·T碱基对转换为G·C碱基对。总的来说，CBE和ABE可以实现所有4种可能的过渡突变（C到T，G到A，A到G，T到C）［18］。

胞嘧啶碱基编辑（CBE）：一种APOBEC1（Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 1）胞苷脱氨酶可以通过脱氨基将胞嘧啶的外环胺生成尿嘧啶［19］，将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），进而通过DNA复制或者修复的方式转化为胸腺嘧啶（T）。基于此原理，该系统不断优化。到目前为止，CBE3系统通过APOBEC1胞苷脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制剂（Uracil glycosylase inhibitor，UGI）及nCas9-D10A（Cas9 nickase，nCas9）突变体的融合表达，已成功在小麦、水稻、玉米等物种上实现安全高效的C到T的碱基替换编辑，且碱基替换与删除出现的概率很低［20］。

腺嘌呤碱基编辑（ABE）：ABE由来自大肠杆菌（Escherichia coli）中的腺苷酸脱氨酶（tRNA adenosine deaminase enzyme，TadA）的突变体TadA*和nCas9-D10A突变体组成，TadA*可将腺嘌呤（A）脱氨变为肌苷（Inosine，I），肌苷（I）在DNA复制时被识别为鸟嘌呤（G），最终实现A到G的变换。经过不断的进化改造，ABE7.10系统是目前报道的效率最高且与应用最广的ABE系统［16，21］。

2.3 DNA-free编辑

不同于常规植物基因组编辑的转化手段，DNA-free编辑是指通过粒子轰击或者PEG介导的方式将CRISPR/Cas9的体外转录物（Delivering in vitro transcripts，IVTs）或核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein complexes，RNPs）直接转入植物细胞完成对靶基因的编辑。DNA-free的编辑系统不仅消除CRISPR/Cas9随机整合到基因组DNA中的几率，而且改良了常规转化中存在的问题，如较高的潜在脱靶效应、易出现嵌合体、需通过后代分离方可获得无CRISPR/Cas9的植物突变体。

2.4 RNA编辑

RNA编辑的主要优点在于不改变编码基因本身，更加可控、不会遗传且效率较高（同时靶向编辑多个基因的转录本）。2014年，Jennifer Doudna团队发现Cas9酶可与PAM序列共同作用，识别并结合到单链RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）的特异位点上［22］。随后，张锋团队从多种细菌中找到一种能够切割大肠杆菌报告基因的Cas13a酶，开发出由单一RNA引导的CRISPR/Cas13a系统（也称为CRISPR/C2c2），该系统可特异性的降低哺乳动物细胞中的内源RNA和报告RNA水平［23］。最近，美国芝加哥大学的Dickinson研究团队构建出一套以CRISPR/Cas为基础的RNA靶向系统（CRISPR-Casinspired RNA targeting system，CIRTS），可将一系列效应因子（包括核酸酶、降解机制、翻译激活因子和碱基编辑器）传递到目标转录本上［24］。

通过活性位点突变及与其他功能性蛋白进行融合，该技术已经能够成功对RNA进行单碱基编辑。在哺乳动物中使用的RNA单碱基编辑融合蛋白均来源于ADAR家族腺苷脱氨酶，该酶的脱氨基域（Deamination domain，DD），即ADARDD，能催化水解腺苷（A）脱氨，将腺苷（A）转化为肌苷（I）［25-26］。张锋团队设计了REPAIR系统（RNA Editing for Programmable A to I Replacement，REPAIR），该系统将以RNA为导向的dCas13b，即dPspCas13b，融合到ADAR2DD（E488Q）突变体，在哺乳动物细胞中实现了腺苷（A）替换至肌苷（I），而肌苷（I）在碱基互补配对时行使鸟苷（G）的作用，从而造成A到I到G的转变［27］。最近该团队在REPAIR的基础上，对ADAR2进行改进，构建出新的RNA编辑系统RESCUE（RNA Editing for Specific C-to-U Exchange，RESCUE），使ADAR2腺苷脱氨酶具备将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）的能力，实现了C到U的RNA编辑，且该系统仍保留将A转化为I的功能［28］。

2.5 其他应用

通过改良编辑系统的不同部分，还可以将CRISPR的应用继续扩展，比如通过Cas9或其变体与不同效应因子连接可以实现基因定位［29］、转录调节［30］、表观修饰［31］与活细胞成像［32］，还可以进行基因组以及药物筛选［33-34］。

3 CRISPR/Cas在作物育种上的运用

现代农业育种的目标主要是培育高产优质、抗虫抗病的品种，传统育种周期漫长，而传统转基因技术的应用又受各种风险因素限制。近年来，我国已在作物分子育种方面积累了一定的成果，现已在不同作物当中鉴定并分离克隆大量产量、品质、抗除草剂、抗虫抗病、代谢调控和抗非生物逆境胁迫相关的基因，这些基因的有效利用将推动作物育种的快速发展，而CRISPR/Cas基因编辑技术具有高效的定点编辑能力，可实现更为可控且准确的基因组编辑，所以该技术在作物育种方面具有广阔应用前景。

3.1 提高产量

作物育种最主要的目的就是提高产量，产量指标的构成主要包括穗数、每穗实收粒数及粒重。水稻中的miR396e和mi396f是水稻株型和粒重的重要调控基因［35-37］，朱健康团队通过基因敲除获得miR396e/f的双突变体，发现该突变体穗型增大，千粒重增加40%左右［38］。

DEP1（Dense and erect panicle 1）是控制水稻穗粒数的显性基因，在我国北方主栽粳稻品种中，当DEP1基因在第5个外显子上存在625个碱基对的缺失，表现为茎顶端分生组织活性提高，株高变矮，枝梗数和穗粒数增加，产量提高［39］。Wang等［40］通过设计4个sgRNAs在籼稻（自交系IR58025B）中实现该基因的大片断敲除，得到具有密集直立圆锥花序、株高降低且具有增产潜力的水稻材料。

GW2（grain weight 2，GW2）基因编码E3泛素链接酶，在水稻、玉米、小麦籽粒发育过程中起负调控作用，Wang等［41］利用CRISPR/Cas9对小麦籽粒重基因TaGW2进行敲除，突变体籽粒大小和千粒重明显增加；同年，高彩霞与王道文团队通过CRISPR/Cas9技术分别靶向3个同源基因TaGW2-A1、-B1和-D1的特异性区域，创制了4个TaGW2的突变体材料：TaGW2-B1和TaGW2-D1的单突变体、TaGW2-B1和-D1的双突变体以及TaGW2-A1、-B1、-D1的三突变体。比较发现3个基因均负调控小麦籽粒的宽度、长度、千粒重及平均单株产量，且TaGW2-B1的作用效果强于TaGW2-D1［42］。

3.2 改善品质

随着人们生活水平的提高，要求培育的新品种作物不仅具有更高、更稳的产量，而且应该具有更好、更全面的产品品质。

花青素属于生物类黄酮物质，是在自然界广泛存在与植物中的天然水溶性色素，其最主要的生理性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。富含原花青素和花青素的野生稻（Oryza rufipogon L.）籽粒显红色，该性状受到Rc和Rd两个互补基因的调节［43-44］，Rc编码一个基本的螺旋-环-螺旋结构的转录因子，而Rd编码一个二氢黄酮醇4还原酶蛋白。野生稻的RcRd基因型能够产生红色籽粒的表型，而大部分栽培水稻因Rc基因外显子碱基缺失造成移码突变，籽粒呈白色。福建农科院与厦门大学合作利用CRISPR/Cas9将原本移码突变转换为突变碱基为三的倍数的整码突变（in-frame mutation），致使该基因恢复功能，并得到了有较高的原花青素和花青素含量的红稻［45］。

亚油酸是一种对心脑血管健康有害的多不饱和脂肪酸，而FAD2蛋白的作用便是将籽粒中的油酸转化为亚油酸，通过突变该基因便可减少亚油酸的含量［46］。Okuzaki［47］等通过CRISPR/Cas9以FAD2（fatty acid desaturase 2，FAD2）位点BnaA.FAD2.a为靶点对多倍体油菜进行定点诱变，从回交子代中选择FAD2 - aa等位基因的突变植株，在自交子代中筛选到纯合植株。与野生型油菜相比，该纯合突变体材料籽粒当中油酸含量增加，亚油酸含量减少。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）是健康人体小肠内难以消化吸收的淀粉及淀粉降解物的总称，摄入高抗性淀粉食品可有效预防和控制糖尿病，并对肥胖症和肠道疾病起到积极预防作用［48］。淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）是水稻淀粉合成过程中的关键调控酶之一，夏兰琴团队运用CRISPR/Cas9技术对SBEII进行敲除后发现，直链淀粉和抗性淀粉含量分别提高到25%和9.8%［49］。

3.3 除草剂的耐受性与抗性

通过外源基因导入是获得抗除草剂作物的传统方法，但因为是属于转基因作物，其在重要粮食作物中的推广应用受到限制，因此通过基因编辑提高重要农作物的除草剂抗性成为目前基因组编辑研究领域的热点之一。

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草剂，目前生产上推广的抗草甘膦作物，几乎全部为通过导入农杆菌属的CP4菌株的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因，即EPSPS（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）基因获得的，商业化受到极大的阻碍。高彩霞和李家洋团队合作利用CRISPR/Cas9技术，通过非同源末端连接（NHEJ）修复方式在水稻中实现了EPSPS基因的定点替换，在T0代获得对草甘膦具有抗性的水稻材料［50］。

小麦遗传背景复杂，利用传统的育种方式培育抗除草剂品种具有一定的难度。高彩霞、姜临建和李家洋团队合作利用单碱基编辑技术对小麦乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase，ALS）和乙酰辅酶A羧基化酶基因（Acetyl CoA carboxylase，ACC）进行编辑，获得耐受磺酰脲类、咪唑啉酮类和芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂的小麦材料［51］。同样，扬州大学和上海师范大学团队合作利用CRISPR/Cas9介导的胞嘧啶碱基编辑技术，成功在油菜乙酰乳酸合成酶基因BnALS中引入P197S和P197F的突变，创制出苯磺隆除草剂抗性的油菜［52］。近日，高彩霞和李家洋团队再次合作设计了可以饱和突变并促进植物基因定向进化的基因编辑器STEME（Saturated targeted endogenous mutagenesis editors，STEME），并利用20个sgRNA在水稻原生质体中对乙酰辅酶A羧基化酶基因ACC的CT结构域的168个碱基序列产生了接近饱和的诱变，并筛选得到与除草剂分子结合能力减弱的氨基酸突变体材料，从而成功获得了水稻对除草剂的抗性［53］。

水稻OsSF3B1（Splicing factor 3b subunit 1，S3B-1）是一个真核细胞物种保守基因，植物中自然产生的剪接抑制剂在RNA剪接中起到非常重要的作用［54-55］。在农作物中，RNA剪接抑制剂是一种有效的除草剂［56］。Butt等［57］运用CRISPR技术对水稻OsSF3B1基因的保守结构域HR15-17进行突变，经过除草剂的筛选，最终获得了21株抗除草剂的水稻植株。

3.4 抗虫性

植物当中5-羟色胺和水杨酸的生物合成来自共同的源头物质［48］。浙江大学等单位以水稻为材料，发现两者的生物合成存在相互负调控现象，同时也发现通过调控植株体内5-羟色胺生物合成，水稻会对害虫表现抗性。细胞色素P450基因CYP71A（cytochrome P-450LXXIA1，CYP71A）编码5-羟色胺，该团队利用基因编辑技术CRISPR/Cas9技术突变CYP71A，快速筛选培育出了抗褐飞虱、抗螟虫的非转基因水稻材料［58］。

3.5 非生物胁迫抗性

高温、寒冷、干旱和重金属毒害等非生物胁迫对作物的生长发育、产量和品质产生严重影响，是导致农业减产的重要因素，应用基因工程方法提高作物对非生物胁迫的耐受能力，是作物分子育种面临的重要挑战之一。

镉（Cadmium，Cd）是对人体有害的一种重金属，会引发骨质疏松、肾功能衰竭、癌症及心血管疾病等［59］。镉超标的大米是膳食镉摄入的主要来 源［60-61］。OsNramp5（Natural resistance-associated macrophage protein，Nramp5）基因调控水稻体内金属离子的转运，该基因使植株具有吸附环境中Cd的能力并将其在籽粒中大量富集［62-63］。袁隆平团队通过利用基因编辑技术敲除该基因，发现突变体芽和根中的Cd浓度明显降低，且对植物产量影响不显著，最终在高镉土壤中筛选鉴定出耐Cd水稻基因编辑材料［64］。

玉米ARGOS8（Aluminum-induced Protein Superfamily Pseudogene，ARGOS8）基因是植物乙烯反应的负调控因子，过表达ARGOS8的转基因植物在干旱胁迫条件下对乙烯的敏感性减弱，产量提高［65］。Shi等［66］通过CRISRP系统对玉米进行基因编辑，在该基因上游非编码区插入玉米GOS2启动子以代替ARGOS8的天然启动子，产生了乙烯反应负调节因子ARGOS8的新变种，与野生型玉米相比，该材料对干旱的抗性增强。

MicroRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，大小约为19-22 nt，其主要在发育过程中调节内源基因表达［67］。2018年，朱健康团队利用其改良的基因编辑技术（Short Tandem Target Mimic，STTM）敲除水稻microRNA166，其中发现突变植株的叶片植株气孔疏导能力降低，蒸腾速率降低，抗旱性增加，从而获得 miRNA166低表达抗旱水稻新品系［68］。

3.6 抗病性

病害是影响我国农业生产的重要因素，而现在主要的防治方法仅仅是提前消毒种子或在症状出现后喷施农药，但效果仍然不理想。但想要从根源上解决病害这一问题，抗病作物品种选育至关重要。

水稻白叶枯病是亚洲和非洲的一种重要病害，病原体为水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo），该菌利用一组III型转录激活子效 应 物（TALes）诱导宿主SWEET（Sugars Will Eventually be Exported Transporters，SWEET） 基 因表达，致使宿主易感该病［69-70］。Zhou等［71］通过CRISPR/Cas9技术敲除OsSWEET13基因，提高水稻对该病的抗性，且证实了稻瘟病菌主要是通过提高宿主细胞对蔗糖的合成来侵染宿主。最近，杨兵课题组通过CRISPR系统突变SWEET11、SWEET13和SWEET14三个基因的启动子，并在突变体中不断筛选鉴定得到对白叶枯病具有强大广谱抗性的水稻株系［72］。

稻瘟病是世界上危害水稻最严重的病害之一，稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）属于半知菌亚门真菌，可引起大幅度减产。植物乙烯应答因子（Plant ethylene responsive factors，ERF）是植物APETELA2/乙烯应答因子（AP2/ERF）转录因子超家族的一个亚家族，它参与了多种胁迫耐受的调节，并参与了多种对非生物胁迫和生物胁迫的响应［73-75］。赵开军团队以稻瘟病感病品种空育131为材料，利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除OsERF922（Ethyleneresponsive transcription factor 2，ERF922），获得的T2纯合突变系在苗期和分蘖期对稻瘟病菌的抗性相比野生型都有显著提高［76］。

水稻矮化病（Rice tungro disease，RTD）是亚洲热带地区水稻生产的严重制约因素，RTD是由水稻球形病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）与水稻杆状病毒相互作用引起的，具有RTSV抗性的植株大部分也表现出RTD抗性［77］。自然RTSV抗性是由翻译起始因子基因（The translation initiation factor 4 gamma，eIF4G）控制的隐性性状，eIF4G蛋白中Y1059V1060V1061氨基酸残基发生单核苷酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）或缺失而获得抗性［78］。利用该特性，Macovei等［78］利用CRISPR/Cas9系统诱导RTSV敏感品种IR64中的eIF4G突变，该团队在温室条件下筛选并鉴定到不含Cas9序列且具有RTSV抗性的相对高产植株。

小麦白粉病是一种世界性病害，小麦白粉病菌（Blumeria graminis）属子囊菌亚门真菌。该病主要侵染作物的叶片与叶鞘，通过分生孢子或子囊孢子借气流传播到感病小麦叶片上。MLO（Mildewresistance locus，MLO）是大麦、小麦等作物中白粉病菌成功侵染所必需的基因［79］。该基因突变后，大麦表现出对白粉病菌的持久、广谱抗性［80］。WANG等人通过TALEN与CRISPR/Cas9技术在六倍体小麦中编码抗霉位点的蛋白的3个等位基因TaMLO-A1、TaMLO-B1、TaMLO-D1中引入靶向突变，得到对白粉病具有广谱抗性的小麦［81］。

总之，CRISPR/Cas系统是作物分子育种的最新且最有效的途径。表1总结了近年来CRISPR/Cas在作物育种上的应用，其包含了目标性状靶基因、编辑类型和作物种类。

表1 CRISPR/Cas系统在作物育种上的应用

4 CRISPR/Cas局限性

如今CRISPR/Cas系统已经在真核生物当中得到广泛运用，尤其是动物当中，其研究进展十分迅速。植物基因编辑进展相对落后的原因，除了动植物本身之间的差异以外，CRISPR/Cas系统自身的缺陷也对编辑效率产生影响。

4.1 PAM序列的限制

目前被广泛研究并应用于植物编辑当中的CRISPR核酸酶包括来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9和来自毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium）的LbCpf1，SpCas9需要识别编辑靶位点的“NGG”PAM序列行使功能，LbCpf1则需要严格识别“TTTV”PAM位点发挥作用，在实际应用时，这对于特定靶位点的选择存在一定限制。因此，如何有效拓展CRISPR核酸酶PAM位点范围，成为CRISPR系统在植物基因组编辑中广泛应用的关键。

日本横滨市立大学Seiichi Toki团队通过定点突变发现，SpCas9的突变体SpCas9-NGv1（R1335A/ L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R /T1337R）可以在水稻和拟南芥基因组中以NG为PAM进行有效突变［91］。

xCas9是最近发现的一种识别哺乳动物细胞中大多数PAM类型的Cas9变体，包括NG、GAA和GAT，xCas9已被证实可在水稻中进行基因敲除以及碱基替换［56］。中国电子科技大学张勇团队和美国马里兰大学戚益平团队通过构建来自弗朗西斯菌属（Francisella novicida）的FnCpf1、LbCpf1核酸酶的RR及RVR突变体表达系统，成功实现了以“CCCC”、“TYCV”、“TATG”为PAM位点的水稻基因组编辑，扩大了Cpf1核酸酶在植物基因组编辑中的应用范围［92］。以上研究不仅有效地拓展了CRISPR的应用，而且显著提高了植物基因组的编辑范围，但仍需进一步对其进行优化，在扩大编辑范围的同时提高编辑效率。

4.2 转化系统的限制

植物基因编辑效率的提高在一定程度上依赖于高效的转化系统，目前常用的转化系统包括农杆菌介导法、基因枪轰击法及PEG转化法（Polyethylene glycol，PEG），其中农杆菌介导法是最成熟的转化途径，但由于宿主范围的限制，只适用于部分植物物种和组织；基因枪轰击法和PEG转化法靶向受体材料类型广泛，无宿主的限制，但基因枪轰击法由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达；PEG转化涉及到植株再生问题，目前仅有烟草等少数物种可以实现［93］。纳米材料目前已经广泛用于医学领域中，在哺乳动物细胞中，有研究表明纳米颗粒可以运送Cas9蛋白与sgRNA进入细胞，并在30%的细胞中对目的基因进行编辑［94］。CRISPR编辑技术结合纳米颗粒在植物上的应用将克服宿主范围的限制，且适用于广泛的植物物种和不同的组织。该技术的成功应用将快速推进作物的遗传改良进展。

4.3 DNA特异性识别的限制（脱靶）

除了扩大基因组的编辑范围，DNA的特异性识别也是需要攻破的又一难关。研究人员利用多种方法揭示了基于CRISPR的基因组编辑的DNA靶向特性，但却没有一种方法和算法能证明野生型Cas9蛋白与其同源的sgRNA存在靶外反应。但仍存在很多案例，非靶位点的基因修改接近甚至超越靶位点修改的频率［95］。

通过不断地摸索，研究人员开发出以下几种策略降低脱靶效率：其一为通过简单地截短sgRNA，使其与目标DNA的互补性少于20个核苷酸，结果是SpCas9的非目标修饰可以减少几个数量级［96-97］；其二是在有足够的机会改变靶位点后降低其在细胞中的活性或寿命。例如，直接向细胞传递Cas9与sgRNA核糖核酸蛋白复合物（RNPs），该方法可保证Cas9蛋白的瞬时活性，且在一段时间后该蛋白会在细胞中降解［98］。此外，将Cas9核酸酶的两个残基的其中一个失活，改造其为nCas9，并分别设计两个sgRNA，当两个nCas9同时与DNA链上的靶位点结合时，DNA发生双链断裂，在一定程度上大大减少脱靶几率［99］。

5 基因编辑作物的展望

传统育种中利用的遗传变异主要来自于自然过程、物理或化学的诱变，而这些变异概率低且突变位点不可预测，基因编辑技术与转基因技术均能克服以上缺点，这对作物基因功能研究与遗传育种具有重要的意义，但这两种技术之间也有巨大的差异。转基因技术一直在许多国家被称为基因改造技术（Genetic modification），是将外源基因导入特定作物基因组当中并使其表达相应的产物的新型育种技术，这些基因可以来自同一物种内部，也可以跨越物种边界来生产新的作物。其核心在于具有表达优良性状能力的外源基因的导入，通过后代筛选保留该优良性状。与转基因作物育种不同的是，基因编辑作物育种仅用于编辑作物内源基因，且可以通过后代的杂交分离将导入的外源基因剥离，所以经过基因编辑育种获得的品种完全不含外源基因。

未来基因编辑育种技术在作物改良育种方面的发展大概有以下几种思路：第一，许多作物的全基因组测序已经完成，而大多数已测序的基因功能仍未知。通过基因敲除创建全基因组水平的大规模突变体文库是该工具未来应用的必然趋势，此举对于功能基因组研究与作物改良具有重要意义；第二，作物的优良性状往往依赖复杂的代谢网络进行调控，而除了敲除外该工具还可以通过调控基因的上下游序列或转录因子致使某些基因表达或被抑制。甚至该工具可直接调控RNA，在不影响遗传的情况下直接在转录水平进行调控，这可以直接用来评估调控区域与表型的关系进而促进作物育种；第三点是优秀的品系往往需要集各种优良性状于一身，这需要多个控制优良性状的基因组同时表达，因此能够同时操控并调控多个基因的基因编辑技术具有重要的应用价值［100］。

利用基因编辑技术进行作物改良育种的优势已经显而易见，但在能否市场化的问题上还存在较大争议。到目前为止，欧盟已经批准了大约118种转基因生物，但大多数转基因生物是用来喂养动物的，只有极少数是供人类直接食用，欧洲几乎没有转基因食品的市场，基因编辑作物被一并认为是转基因技术产物并按照该技术对其进行监管［101］。与欧盟的态度不同，2016年宾夕法尼亚大学利用基因编辑培育的抗褐变蘑菇，在美国并未受到监管［102］。此举标志着美政府对该技术的缓和态度，而在2018年，美国农业部正式发布声明，表示不会对一些新育种技术的作物进行监管，而其中就包括基因编辑技术。

由于各国对于基因编辑及其产物定义并不统一，因此各国的管理方法与管理现状也不尽相同。而对于全世界来说，这种新颖的生物技术所带来的意义十分深远，其不光在农业与医学方面带来全新的局面，还会对社会的经济贸易方面造成影响。只是现在这种不稳定的局面还无法让其飞速拓展开来，但随着基础研究的加深与其他学科的发展，该技术定将获得大众接受并广泛应用。中国作为农业大国，其粮食作物产量近年来屡创新高，但这些产量的背后是除草剂与化肥的不合理使用造成的环境破坏问题与无法应对日渐恶劣的环境而逐渐枯竭的优良品种。基因编辑技术对于中国农业的发展以及提高产业创新能力具有重大意义。相信在不久的将来，我国将具备该技术的成熟体系，并将其产业化以服务农业，在新的农业革命当中领先于世界。