桂东九头狮子草红色素的纯化及其稳定性研究

梁冬梅，伍淑婕，汤 泉

（1.贺州学院材料与化学工程学院，广西 贺州 542899；2.贺州学院食品科学与生物工程学院，广西 贺州 542899）

九头狮子草［Peristrophe japonica (Thunb.) Bremek.］，为爵床科观音草属植物，又名红蓝草等，主要分布在我国贵州、广西、广东等地[1]，尤其在广西桂东地区资源更为丰富。研究表明，九头狮子草含有多种活性成分，如黄酮类化合物、生物碱、有机酸及微量元素等[2]，具有降酶保肝作用[3]、降压作用[4-5]等，还是一种较稳定安全的药食兼用的天然色素源[6]。

随着社会经济的发展，相关行业对天然色素产量和品种的要求逐渐增加，作为食品添加剂来开发的天然食用色素替代合成色素，已成为热点研究课题[7-9]。本课题以桂东生长的九头狮子草为原料，进行红色素提取，利用大孔树脂进行纯化，并研究其稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

种植于贺州学院东校区九头狮子草基地的新鲜九头狮子草，洗净，晾干，备用。

大孔树脂 (D-101、NKA-9、AB-8、S-8)、无水乙醇、蔗糖、葡萄糖、维C、氯化钠、柠檬酸、碳酸氢钠，氯化钾、硫酸镁、三氯化铝等（均为分析纯）。

1.2 主要仪器及设备

HHS型数显式电热恒温水浴锅，SHZ-D Ⅲ型循环水真空泵，RE52CS型旋转蒸发仪，TU-1901双光束紫外可见光分光光度计，SP-722分光光度计，层析柱 (30cm×50 cm，30cm×70 cm)。

1.3 实验方法

1.3.1 可见光范围最大吸收波长的确定

1）大孔树脂的预处理：按参考文献[10]描述的方法，大孔树脂先用无水乙醇浸泡24h，再用去离子水洗至无乙醇味，过滤，常温下保存，备用。

2）色素粗液的制备：取新鲜九头狮子草全株剪碎，称取20g放入三角烧瓶中，加入蒸馏水250mL，在100℃沸水中提取2h，提取2次。合并提取液，过滤，浓缩至干，获得色素粗品。

3）可见光范围最大吸收波长的测定：对九头狮子草红色素溶液进行紫外光谱扫描，确定其在可见光范围的最大吸收波长。

4）分析计算公式：

其中：A为吸光度值；V为体积，mL；Y为收率，%；m为质量，g。

1.3.2 纯化条件的研究

1）静态吸附用大孔树脂：分别取预处理过的树脂各5.00g，加入吸光度为A0的粗色素溶液25 mL，25℃下浸泡24 h。测定上清液的吸光度，计算吸附率。

2）静态吸附的动力学特征研究：准确称取预处理过的大孔树脂5.00 g，装入100 mL具塞磨口锥形瓶中，加入吸光度为A0的色素粗提液25 mL，25℃下恒温震荡，每20 min取上清液测定吸光度，直到达到平衡为止。做吸附率-时间曲线。

3）最大吸附量的确定：称取预处理过的大孔树脂5.00 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加入吸光度为A0的九头狮子草提取液 25、50、75、100 mL，25℃震荡吸附12h，测定吸光度，并计算总吸附率。总吸附率即为最大吸附量。

4）静态解吸考察不同乙醇浓度下的解吸率：取适量已吸附九头狮子草红色素的树脂11组，分别加入10倍体积、不同体积分数的乙醇水溶液（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），震荡12h后过滤，取滤液测定最大吸收波长处的吸光度。

5）动态等度洗脱：取适量活化的树脂装柱（30cm×50cm），将九头狮子草红色素原液按最大吸附量上柱，静态吸附4h后水洗至A＜5%A0，按最大解吸率的乙醇浓度，洗至吸光度A＜5%A0。

6）动态梯度洗脱：取适量活化的树脂装柱（30cm×70cm），将九头狮子草红色素原液按最大吸附量上柱，静态吸附4h后水洗至A＜5%A0，按不同的乙醇浓度（20%、40%、60%、80%和100%），洗至吸光度至A＜5%A0，测定解吸率。

1.3.3 稳定性评价

1）温度的影响：配制浓度为0.1 mg·mL-1的色素溶液，分别取该溶液5mL，在不同温度（室温、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）下恒温1h，冷却至室温后测吸光度，评价色素在不同温度下的稳定性。

2）溶液pH值的影响：配制浓度为0.1mg·mL-1的色素溶液，分别取该溶液5mL，调pH值，并定容到 10mL，使得溶液的 pH 值分别为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，室温下震荡 1h 后测吸光度，评价色素在不同pH值下的稳定性。

3）常用食品添加剂的影响：配制浓度为0.1mg·mL-1的色素溶液，分别取该溶液5mL，并加入相同体积的1.0%和0.1%的常用食品添加剂溶液（蔗糖、葡萄糖、VC、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、苯甲酸钠、亚硫酸钠、碳酸氢钠），室温震荡1h后测吸光度，评价色素在常用添加剂溶液中的稳定性。

4）常见金属离子的影响：配制浓度为0.1mg·mL-1的色素溶液，分别取该溶液5mL，加入相同体积、浓度为1.0%的常见金属离子的盐溶液（NaCl、KCl、MgSO4、AlCl3、CuSO4、FeCl3），室温震荡 1h 后测吸光度，评价色素在常用添加剂溶液中的稳定性。

2 结果与分析

2.1 九头狮子草红色素在可见光范围的最大吸收波长

准确称取1.1210g九头狮子草红色素粗品，溶于1L蒸馏水中，进行紫外光谱扫描，溶液在480 nm处有最大吸收波峰（图1），与蒋红芝[7]的研究结果相近。

图1 九头狮子草红色素溶液最大吸收波长

2.2 桂东九头狮子草红色素的纯化

2.2.1 静态吸附用大孔树脂

分别称取5.00g的4种不同类型的大孔树脂置于100mL锥形瓶中[11]，各加入A0=0.906的色素溶液25mL，静态吸附24h，取溶液上清液测定吸光度值，根据式（1）计算出不同类型大孔树脂的吸附率（表1）。由表1可看出，D-101的吸附率最高为81.18%，AB-8次之，故选择D-101为纯化树脂。

表1 不同树脂对九头狮子草红色素的静态吸附结果比较

2.2.2 静态吸附动力学结果

准确称取5.00g的D-101树脂，加入吸光度值为A0=0.501的色素溶液25mL，在25℃下进行吸附，每20 min取上清液测定在480nm处的吸光度，结果见图2。由图2可知，D-101树脂对九头狮子草红色素有快速的吸附能力，速率变化区间明显。

图2 D-101对九头狮子草红色素的静态吸附动力学结果

2.2.3 最大吸附量的测定结果

利用式（3）计算出总吸附率，即最大吸附量。D-101树脂对九头狮子草红色素的总吸附率结果见图3。由图3可知，随着色素体积增大，树脂在10BV时，总吸附量最大值为12.425，最大吸附量为2.484。

图3 最大吸附量的测定结果

2.2.4 不同乙醇浓度对色素的静态解吸影响

准确称量已吸附色素的大孔树脂各1.00g，分别加入各个浓度的乙醇溶液10mL，吸附12h后取上清液测480nm处的吸光值，根据式（2）计算出各个乙醇浓度的解吸率。由图4可知，乙醇浓度为60%时，树脂对九头狮子草红色素有最佳的解吸效果，解吸率为79.85%。

2.2.5 等度洗脱

准确称取10.0050g活化的D-101树脂装柱，加入A0=0.723的色素溶液50mL ，静态吸附4h后用水洗至A＜5%A0，用60%乙醇浓度洗脱，每20min取洗脱液测定一次吸光度值，直至A＜5%A0，计算各个时间段内洗脱液的解吸率。由图5可知，60%浓度的乙醇在40min前的解吸率上升较快。

图4 乙醇浓度对九头狮子草红色素的静态解吸影响

图5 等度洗脱结果

2.2.6 梯度洗脱

准确称取36.0100g的D-101树脂装柱，加入200mL、A0=0.886的色素溶液，静态吸附4h后，水洗至A＜5%A0，按式（4）计算出各个乙醇洗出液浓度的收率。由图6可知，色素多集中在60%乙醇中，40%乙醇次之。因此，梯度洗脱可以更好地分离、纯化九头狮子草红色素。

图6 梯度洗脱结果

2.3 桂东九头狮子草红色素稳定性的影响因素

2.3.1 温度对九头狮子草红色素稳定性的影响

温度对九头狮子草红色素稳定性的影响见图7，可知吸光度随温度的变化不大，热稳定性较好。

图7 温度对九头狮子草红色素稳定性的影响

2.3.2 溶液pH值对九头狮子草红色素稳定性的影响

由实验结果及图8可知，九头狮子草红色素在pH小于8时，颜色随着酸性的增强发生红色→紫红→紫色的变化；当pH在10～14时，颜色为橙黄色。可知色素应在弱酸弱碱（pH=5～11）条件下使用，避免在强酸或强碱条件下使用。

图8 pH对九头狮子草红色素稳定性的影响

2.3.3 常用食品添加剂对九头狮子草红色素稳定性的影响

在九头狮子草红色素溶液中加入常见的食品添加剂，测定480nm处的吸光度如表2所示，可见九头狮子草红色素在常见的食品添加剂溶液中具有较好的稳定性。

表2 常用食品添加剂对九头狮子草红色素稳定性的影响

2.3.4 常见金属离子对九头狮子草红色素稳定性的影响

常见金属离子对九头狮子草红色素的稳定性影响结果见图9。可见色素在Na+、K+、Mg2+的溶液中较稳定，在Cu2+、Fe3+、Al3+溶液中的吸光度值有较大变化。

图9 常见金属离子对九头狮子草红色素稳定性的影响

3 结论

采用D-101大孔树脂纯化桂东九头狮子草红色素，可获得纯度较高的天然色素。稳定性研究结果表明，其溶液在通常的温度下能保持稳定，在中性溶液或弱酸弱碱性食品添加剂溶液中的稳定性较好，在强酸溶液中颜色由红变紫，在强碱溶液中颜色由红变黄绿；在常用的食品添加剂溶液中具有较好的稳定性。金属离子对色素溶液有不同的影响，在含 Na+、K+、Mg2+的溶液中稳定，在含 Cu2+、Fe3+、Al3+的溶液中，吸光度值有较大变化。九头狮子草红色素作为食品添加剂应用于食品加工，可获得较好的顔色效果，因此，开发和利用九头狮子草色素产品，将会大大降低合成色素对人体带来的危害。