NLRP3炎症小体在神经血管疾病中的作用①

董晓庆 丁艳平 张晋平 邵宝平 (西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

神经血管疾病(neurovascular diseases)是脑或脊髓血管异常所致的疾病，包括脑卒中、脊髓血管畸形、神经系统肿瘤等一系列广泛疾病[1]。神经血管疾病的炎症反应是一个复杂的过程，包括神经胶质细胞固有免疫系统的激活及循环中白细胞的浸润等[2]。炎症小体在神经血管疾病中的炎症反应中起关键作用，近几年来炎症小体逐渐成为神经血管疾病研究中的研究热点。炎症小体通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别病原微生物以及内源性危险信号，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和危险相关分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)而被激活[3]。NLRP3炎症小体是核苷酸结合和寡聚化结构域样受体(nucleotide binding and oligomerization domain like receptors，NLRs)家族中的一种蛋白复合体，在小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、内皮细胞等细胞中多样性表达，其在缺血性脑卒中、AD、TBI、脑瘤等多种疾病的发病机制中起重要作用[4]。

1 NLRP3炎症小体的分子结构

目前，NLRP3炎症小体是在神经血管疾病领域研究最多的炎症小体，而其参与的神经血管疾病过程通常与IL-1β的成熟与分泌有关。NLRP3(也称为cryopyrin和NALP3)是最具特征性的炎症小体，其主要由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speckle-like protein containing CARD，ASC)及pro-caspase1组成(图1)。NLRP3 主要包含3 部分： C 端的亮氨酸重复序列(leucine-rich-repeat domain，LRR)，其作用是识别微生物及内源性危险信号；中段是特征性的核苷酸寡聚化结构域(nucleoside triphosphatase domain，NACTH)，介导脱氧核苷三磷酸酶(deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase,dNTPase)的活化以及NLR寡聚化并形成炎症小体的核心结构；N 端的效应结构域，主要包括热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)、胱天蛋白酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)及杆状病毒凋亡抑制重复结构域(baculovirus inhibitor of apoptosis repeat domain，BIR)等，参与信号传导过程[5]。

2 NLRP3炎症小体的激活

目前普遍接受的NLRP3炎症小体激活模型分为两步(图2)：第一步启动和第二步激活。

2.1第一步启动 在静息状态下，除了ASC、IL-18以外，NLRP3和IL-1β在细胞中表达量处于极低水平，不能用于组装或活化NLRP3炎症小体，需要激活的 NF-κB 转录出 NLRP3 mRNA[6],再进行翻译及翻译后修饰等,此过程为 NLRP3 priming。此外，NLRP3的基础水平可以保持在不活跃但有应答的泛素化状态，并通过泛素连接酶相关蛋白(suppressor of G2 allele of skpl，SGT1)和热休克蛋白90(heat shork protein 90 kD，HSP90)隔离。因此，在NLRP3能够与其他炎症小体成分结合并进行低聚之前，启动的第一步是增加NLRP3和pro-IL-1b蛋白水平，或者是对现有NLRP3水平进行转录后修饰，调控NF-κB 活性的分子可以间接影响NLRP3 priming[7]。

图1 NLRP3炎症小体结构示意图Fig.1 Schematic diagram of NLRP3 inflammasome

图2 NLRP3炎症小体的激活模型Fig.2 Models of NLRP3 inflammasome activation

2.2第二步激活 由于不同的NLRP3炎症小体激活剂的性质不同，所以炎症小体激活所涉及的不同方面或特定途径很难达成一致意见，但是目前对于不同的信号事件和相关的亚细胞细胞器作为直接参与炎症小体激活的途径普遍认为主要包括以下几个方面：内质网应激[8]、溶酶体破裂和自噬、钾离子外排(K+)、线粒体、氧化应激。

2.2.1内质网应激 内质网应激的发生是由于内质网中未折叠蛋白积累增加或内质网中Ca2+稳定性紊乱造成的。内质网应激可能导致对未折叠蛋白质反应(unfolded protein response，UPR)[9]的刺激，这可能导致适当的修复/生存反应，或者如果达到极端细胞应激水平或极端的UPR，则会对细胞产生不利影响。最初，发现多个内质网应激物诱导NLRP3炎症小体活化，独立于典型的UPR启动子(PERK，IRE1α和ATF6)蛋白[9]。然而，最近的两项研究表明TXNIP是ER应激诱导的NLRP3炎症小体激活的关键介质[10]。

2.2.2溶酶体破裂和自噬 尿酸晶体、明矾、石棉等炎症小体激活剂可诱导吞噬作用。因此，NLRP3炎症小体激活可以通过其诱导的吞噬体或溶酶体的不稳定化和其内容物的释放而发生。关于溶酶体破裂和其内容物释放到胞质溶胶中如何触发NLRP3炎症小体激活的确切信号细节仍不完全清楚。一些报道表明用二氧化硅或明矾处理后释放的溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B阻止NLRP3炎症小体激活。尽管如此，也有人表示其对组织蛋白酶B缺陷小鼠炎症小体激活没有影响[8,11]。因此，组织蛋白酶B是否可以作用于主要炎症小体激活事件(如氧化应激)的上游，仍有待解释。

2.2.3K+外排 胞外的ATP 或成孔毒素(如尼日利亚菌素)可通过P2X7嘌呤受体(P2X purinergic receptor 7，P2X7)诱导K+流出，导致NLRP3炎症小体激活。此外，ATP刺激也会导致细胞内Ca2+水平的增加。ATP刺激可以激活磷酸脂肪酶C(PLC)/肌醇三磷酸途径，使内质网快速释放Ca2+达到最大的胞内Ca2+存储量，而升高的Ca2+水平也可以通过刺激内质网应激和释放线粒体活性氧(mROS)或线粒体DNA(mDNA)来促进NLRP3炎症小体激活[12]。

2.2.4线粒体 线粒体被认为是NLRP3炎症小体激活的中心参与者。最近的研究发现,瞬时感受器M2型通道(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2，TRPM2)介导Ca2+内流，诱导mROS的产生从而激活NLRP3[13]。此外，NLRP3炎症小体激活包括将NLRP3和ASC衔接蛋白从内质网和胞质空间重新分布到核周间隙、内质网和线粒体中[14]。该过程中NLRP3炎症小体的激活与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)有直接关联，并且mROS的增加取决于线粒体外膜中电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)同种型1和3的状态[15]。此外，NLRP3与线粒体融合素蛋白-2(mitofusin2，Mfn2)的相互作用是NLRP3炎症小体在RNA病毒感染过程中激活所必需的[16]。NLRP3和线粒体内膜特异性的脂质之间存在直接关联，在NLRP3炎症小体激活中观察到心磷脂抑制炎症小体激活和NLRP3定位至线粒体。然而，这是否涉及心磷脂或NLRP3从内部线粒体膜向外部线粒体膜的移位(反之亦然)尚不清楚[17,18]。

2.2.5氧化应激(oxidative stress，OS) OS是体内氧化与抗氧化作用失衡，导致中性粒细胞炎性浸润、蛋白酶分泌增加、产生大量氧化中间产物[19]。有研究表明提高ROS生成是NLRP3炎症小体激活所必需的信号组分，ROS的增加也可能导致硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)从硫氧还蛋白[(thioredox，TRX)一种常见的抗氧化蛋白防御系统]中解离出来，与NLRP3 相互作用,促进NLRP3 活化[12]。有多种亚细胞来源可增加活性氧的产生，包括NADPH氧化酶、mROS、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶氧化酶等。其中，NADPH氧化酶和mROS是NLRP3炎症小体激活中研究最多的ROS来源[20]。

3 NLRP3炎症小体在神经血管疾病中的作用

3.1缺血性卒中NLRP3炎症小体的作用 脑卒中是一种复杂的全身性疾病，在世界范围内造成高死亡率和高致残率。近年来，越来越多的证据表明先天免疫系统的炎症机制可能导致脑缺血期间神经元和胶质细胞的死亡[21]。NLRP3炎症小体已被证实在检测细胞损伤和介导组织损伤炎症反应中发挥重要作用。因此，靶向NLRP3炎症小体信号的上下游通路可能是治疗中风的潜在靶点。最新研究表明在局灶大鼠缺血模型中，NLRP3炎症小体在脑损伤发生后不久首先在小胶质细胞中被激活，随后在神经元和微血管内皮细胞中表达，但主要在神经元中表达，通过药物抑制NLRP3、IL-1β蛋白水平的降低，有效缓解脑损伤的程度[22]。在小鼠局灶性缺血性脑卒中模型中，静脉注射免疫球蛋白(丙种球蛋白)，可以显著降低NLRP3、IL-1β和IL-18的水平从而达到保护神经元的效果[23]。此外，也有针对炎症小体元件NLRPs、ASC和caspase-1的研究。研究表明在局灶大鼠缺血模型中，雌激素和黄体酮可以在蛋白水平上调节ASC和NLRP3，并降低瞬时炎症小体组分的表达[24]。近年来，针对TXNIP/NLRP3炎症小体激活的研究也成为热点，研究表明伞形菌素通过抑制TXNIP/NLRP3炎症小体激活抑制炎症细胞因子的产生[25]；姜黄素通过抑制内质网应激抑制TXNIP/NLRP3炎症小体激活，从而保护神经细胞在缺血损伤后免受谷氨酸神经毒性的影响[26]。

3.2AD中NLRP3炎症小体的作用 AD是一种慢性、进行性和不可逆的神经变性疾病[26]，其特征是认知功能的恶化、β-淀粉样肽斑块的形成、神经纤维缠结和胆碱能神经元的退化。虽然近年来的病理生理机制还不完全清楚，但最近的一些研究证实NLRP3炎症小体在AD的发病机制中起着关键性的作用[27]。IL-1β是AD固有免疫应答的关键因子，IL-1β的表达在AD患者脑和血浆中均有增加[28]。实验数据表明阻断IL-1β信号通路可减轻AD小鼠模型的认知损害[29]。从小胶质细胞中释放的IL-1β也可以增加负责淀粉样前体蛋白处理酶的活性，最终导致淀粉样蛋白进一步沉积[30]。早期的研究表明了β-淀粉样蛋白沉积周围，小胶质细胞中IL-1β的高表达[31]，而Halle等[31]的研究首次证明β-淀粉样蛋白在体内和体外的小胶质细胞中激活NLRP3炎症小体的形成。最新的研究表明，选择性自噬与炎症反应的调节有关，且可通过NLRP3降解调节IL-1β和IL-18的产生从而影响小胶质细胞活化[32]。总之，这些研究表明了NLRP3炎症小体在AD发病机制中的可能作用。靶向炎症小体信号通路的分子组分似乎是神经保护和AD治疗干预的一个有吸引力的策略。

3.3外伤性脑损伤(TBI)中NLRP3炎症小体的作用 虽然外伤性脑损伤(TBI)后的继发性脑损伤的确切机制复杂且知之甚少，但许多研究表明炎症反应可能是TBI发病机制中的突出特征[33]。巨噬细胞和中性粒细胞侵入到损伤区，产生大量的炎症因子和水肿与脑损伤有关。在TBI模型中IL-1β和IL-18表达明显增加[34]。最近的一项研究表明，TBI可以诱导NLRP3炎症小体的组装、ASC的表达、caspase-1的活化以及IL-1β和IL-18的成熟与释放，NLRP3炎症小体可能是TBI患者有希望的治疗靶点[35]。此外，最近的临床研究发现，在严重或中度颅脑创伤患者脑脊液中炎症蛋白ASC、caspase-1和NALP1水平升高，这也提示NLRP1炎症蛋白可以作为评估TBI的潜在临床生物标志物[35,36]。最近一项研究表明，NLRP3炎症小体抑制剂MCC950(一种有效的具有选择性的小分子)在TBI小鼠模型中对炎症性脑损伤和神经系统具有一定的影响。MCC950对TBI的治疗窗长达6 h，且MCC950的神经保护作用与小胶质细胞活化减少、白细胞募集减少、促炎细胞因子生成减少有关。MCC950减轻了TBI诱导的紧密连接蛋白的损失，并减少了细胞的死亡。这些结果表明，小胶质细胞中的NLRP3炎症小体可能主要参与TBI的炎症反应，使用MCC950特异性抑制NLRP3炎症小体可能是治疗TBI的一种有前途的方法[37]。以上研究表明NLRP1炎症小体和NLRP3炎症小体是TBI发生后中枢神经系统炎症反应的重要组成部分，可能是减轻创伤后脑炎症损伤的新的治疗靶点。

3.4脑瘤中NLRP3炎症小体的作用 恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性脑肿瘤，越来越多的证据表明先天免疫和慢性炎症在癌变和肿瘤进展中起关键作用[38]。近年来，NLRP3炎症小体在癌变和肿瘤发生发展中的作用已被证实。许多内源性或外源性的刺激可作为肿瘤的启动因子激活NLRP3炎症小体，从而活化caspase-1，使得IL-1β和IL-18水平升高[39]。研究表明NLRP3炎症小体在多型性神经胶母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)细胞中具有活性[40]。NLRP3炎症小体可以被不同类型细胞中的不同信号所激活，NLRP3炎症小体可以在大脑内皮细胞中被激活，这可能是血脑屏障在神经免疫和神经炎症过程中一种尚未被探索的作用[41]。此外，在小鼠成胶质细胞瘤模型中证明抑制NLRP3可以减少肿瘤生长，延长小鼠辐射治疗后的生存期，进一步说明NLRP3炎症小体在脑老化与胶质瘤的发展中起重要作用[42]。然而，NLRP3炎症小体在脑瘤进展过程中的潜在机制尚不完全清楚，需要更多的研究来了解炎症小体的特性和其在脑癌的治疗潜力。

4 总结与未来展望

综上所述，大量研究证实了NLRP1和NLRP3炎症小体在中枢神经细胞死亡和神经血管疾病包括中风、AD和TBI疾病行为缺陷中所起的核心作用。在对NLRP3炎症小体的研究中，应将NLRP3炎症小体分子机制的理解与NLRP3炎症小体确切分子结构的信息相结合。进一步分析这些负调控因子和信号，最终有助于我们对NLRP3炎症小体激活进行治疗，并开发更好的治疗方法来预防与NLRP3炎症小体相关的炎性疾病，这对于NLRP3炎症小体作为中枢神经系统疾病的一种新的治疗策略非常重要。