类风湿关节炎患者外周血单核细胞miR-24、miR-132表达及临床意义①

苏显都 林明利 符步远 黎 明 (儋州市人民医院检验科，儋州 571799)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，大多数患者出现不同程度的功能受损和关节畸形，严重影响RA患者的生活质量[1]。有研究证实，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在免疫细胞成熟的各个阶段及免疫稳态维持方面发挥着重要的调节作用，与自身免疫性疾病的发生发展密切相关[2，3]。近期的研究发现，miR-24、miR-132在自身免疫疾病的发病过程中发挥着重要的作用[4，5]。本研究通过检测miR-24、miR-132在RA患者外周血单个核细胞(periph-eral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达水平，分析miR-24、miR-132对RA的诊断价值，旨在为RA的诊断及靶向治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2015年1月～2017年10月儋州市人民医院及中南大学湘雅医院收治的RA患者160例，其中男性38例，女性122例，年龄18～75岁，平均(47.63±11.35)岁。RA诊断符合2009年美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)提出的RA分类标准。选择65例骨关节炎(Osteoarthritis，OA)作为OA组，其中男性16例，女性49例，年龄19～74岁，平均(47.42±11.16)岁。另选取同期体检65名健康者作为对照组，其中男性17例，女性48例，年龄20～72岁，平均(46.85±10.62)岁。选取的研究对象均排除合并其他自身免疫性疾病、感染、恶性肿瘤和重要器官系统疾病。本研究获得医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1分组方法 按照28个关节疾病活动性评分(28 disease activity scores,DAS28)来监测RA患者的疾病活动度，采用DAS28-ESR，其中2.6

1.2.2PBMC分离及总RNA提取 抽取外周血4 ml 于肝素钠抗凝管中，3 000 r/min离心5 min，去除上层血浆，加入等体积 PBS稀释血液，在离心管中加入淋巴细胞分离液(Ficoll)沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血，1 500 r/min离心30 min，用吸管吸取白色层(PBMC)细胞置于新的1.5 ml EP管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml提取剂(Trizol)，于-70℃保存。从-70℃冰箱取出上述保存在EP管的细胞，按照总RNA快速提取试剂盒说明书从中提取总RNA。

1.2.3引物设计与合成 miR-24正向引物：5′AAGTCGTATGACTTATCGACGTC3′,反向引物：5′AATCTTGCTACTACACGATCTT3′；miR-132正向引物：5′ACGTCGTGTAGCTTATAAGACTG3′,反向引物：5′ACTGCTTGTTCTACACACTCTG3′。

1.2.4RT-PCR检测 在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)，以U6为内参照，反应条件为：95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s变性，58℃ 30 s退火，72℃ 30 s 延伸，进行40个循环，每个标本重复做3个孔位。反应完成后进行溶解曲线分析(15 s 95℃，1 min 60℃，15 s 95℃，15 s 60℃)，每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值所经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算PBMC中miRNA的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt实验组标本-ΔCt对照组标本。

2 结果

2.1各组PBMC中miR-24、miR-132比较 RA组PBMC中miR-24、miR-132表达水平均明显高于OA组和对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；而OA组与对照组PBMC中miR-24、miR-132表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组PBMC中miR-24、miR-132比较
Tab.1 Comparison of miR-24 and miR-132 in PBMC of each group

GroupsnmiR-24miR-132Controlgroup650.86±0.130.96±0.11OAgroup650.91±0.181.07±0.14RAgroup1603.62±0.751)2)2.48±0.231)2)F 10.154 7.510P <0.001 <0.001

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with OA group,2)P<0.05.

表2 中高活动组和低活动组PBMC中miR-24及miR-132表达水平比较
Tab.2 Comparison of expression levels of miR-24 and miR-132 in PBMC between moderate and high activity group and low activity group

GroupsnmiR-24miR-132Lowactivitygroup641.20±0.411.14±0.19Moderate-highactivitygroup965.86±1.153.25±0.42t16.51712.604P<0.001<0.001

表3 骨侵蚀组和非骨侵蚀组PBMC中PBMC中miR-24及miR-132表达水平比较
Tab.3 Comparison of expression levels of miR-24 and miR-132 in PBMC between bone erosion group and non-bone erosion group

GroupsnmiR-24miR-132Non-boneerosiongroup731.14±0.391.06±0.17Boneerosiongroup876.12±1.243.48±0.46t18.16313.117P<0.001<0.001

表4 miR-24、miR-132及两项联合对RA的诊断价值
Tab.4 Diagnostic value of miR-24,miR-132 and two combinations in RA

ItemCriticalvalueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)PositivelikelihoodratioNegativelikelihoodratiomiR-241.930.782(0.726-0.841)0.00872.476.080.268.53.0170.363miR-1321.650.865(0.804-0.917)<0.00181.485.288.378.65.5000.218Twocombinations0.925(0.863-0.972)<0.00190.285.888.487.56.3520.114

图1 miR-24及miR-132与Sharp评分、DAS28评分的相关性Fig.1 Correlation of miR-24 and miR-132 with Sharp score and DAS28 score

2.2中高活动组和低活动组PBMC中miR-24、miR-132表达水平比较 中高活动组PBMC中miR-24、miR-132表达水平明显高于低活动组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3骨侵蚀组和非骨侵蚀组PBMC中miR-24、miR-132表达水平比较 骨侵蚀组PBMC中miR-24、miR-132表达水平均明显高于非骨侵蚀组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

2.4miR-24、miR-132及两项联合对RA的诊断价值 miR-24、miR-132诊断RA的临界值分别为1.93、1.65。两项联合诊断RA的AUC(95%CI)为0.925(0.863～0.972)高于单项miR-24[0.782(0.726～0.841)]及miR-132[0.865(0.804～0.917)]，差异有统计学意义(Z=7.352，4.218，P<0.05)，其敏感度和特异度分别为90.2%和85.8%。见表4。

2.5miR-24、miR-132与Sharp评分、DAS28评分的相关性分析 Pearson相关分析显示，RA患者miR-24与Sharp评分、DAS28评分呈正相关(r=0.294、0.286，P<0.05)，miR-132与Sharp评分、DAS28评分呈正相关(r=0.418、0.401，P<0.05)。见图1。

3 讨论

RA是一种多基因疾病，以自身免疫和全身炎症为特征，可造成关节功能逐渐受损，最终导致残疾和死亡[6]。目前RA的病因和发病机制尚未明确，早期诊断并积极治疗对控制RA病情进展和改善预后具有重要的作用。OA是一种由于关节退行性变，导致关节软骨被破坏而引起的慢性关节病，该病早期症状与RA有相似之处，RA需与OA进行鉴别诊断。近年来的研究发现，miRNA参与炎性疾病和自身免疫性疾病的发病过程，可能在RA的发生发展中发挥着重要的作用[7]。Zhu等[8]研究发现，miRNA通过靶向信号调节蛋白α(SIRPα)调控巨噬细胞的浸润、吞噬作用及促炎细胞因子的分泌，参与RA的发生发展。miR-24是一类22～28 bp的单链非编码小分子RNA，在研究果蝇发育的时序性调控过程中被发现，广泛存在于哺乳动物多种组织，发挥其生物学功能[9]。miR-132是长度为22 bp的小分子RNA，miR-132及其相关多态性在类风湿关节炎易感性中具有重要的作用，这种作用有望用于治疗RA[10]。

本研究结果显示，RA组PBMC中miR-24、miR-132表达水平均明显高于OA组和对照组，中高活动组PBMC中miR-24、miR-132表达水平均明显高于低活动组，骨侵蚀组PBMC中miR-24、miR-132表达水平均明显高于非骨侵蚀组。提示miR-24、miR-132在RA患者PBMC中异常高表达，与疾病的活动度、骨侵蚀和骨破坏程度相关，可能参与RA的发生发展。而OA组与对照组PBMC中miR-24、miR-132表达水平比较，差异无统计学意义。可见miR-24、miR-132在OA患者和健康人群中并没有显著差异，但在RA患者中呈高表达，这对RA与OA的鉴别诊断具有重要的意义。有研究发现，miR-24在RA患者中的表达水平均明显高于OA患者，提示miR-24有望作为RA诊断的潜在标志物[11]。Murata等[12]对RA患者的血浆及关节滑液中miR-132进行检测，结果显示关节滑液及滑膜成纤维细胞miR-132表达水平在RA患者中明显上调，且与RA的疾病活动相关，有可能作为RA诊断的生物学标记物。应用ROC曲线分析，结果显示PBMC中miR-24、miR-132对诊断RA均具有一定的价值，且两项联合诊断RA的AUC优于单项，其敏感度和特异度分别为90.2%和85.8%。说明miR-24、miR-132两项联合检测有助于提高RA诊断的准确性，并有望作为分析其发病机制的潜在标志物。Churov等[13]研究表明，外周血miR-24在RA患者中明显升高，miR-24被认为是RA检测最有前途的非侵入性的生物标志物。另有研究显示，RA患者PBMC中miR-132的表达水平明显高于健康对照组，miR-132可作为监测RA疾病活动的潜在有效指标，为RA临床诊断提供更为可靠的实验室检测依据[14]。Sharp评分及DAS28评分是临床上反映RA患者活动度和骨侵蚀严重程度的有效指标[15]。本研究中miR-24、miR-132与Sharp评分、DAS28评分均呈正相关。这进一步说明miR-24、miR-132表达上调与RA的病情活动性相关，参与RA的发生发展，可作为RA诊断、病情判断及疾病活动的生物学标志物。Filková等[16]研究认为，miRNA的表达与RA的炎症反应和病情进展相关，可作为RA诊断的生物标志物和治疗的靶点。

综上所述，miR-24、miR-132在RA和OA患者PBMC中表达存在显著差异，这两种miRNA在OA患者PBMC中呈低表达，而在RA患者PBMC中呈高表达，miR-24、miR-132与RA疾病的活动度和骨侵蚀程度相关，可能参与RA的发生发展。同时还发现，miR-24及miR-132两项联合检测有助于提高RA诊断的敏感度和特异度，这为临床上准确诊断和治疗RA提供新的思路和方法。