抗阿尔茨海默症单链抗体的制备与体外活性研究①

付 璐 张 谦 杨 西 朱禹奇 宋思璇 张凌宇 张文慧 张林波

(吉林农业大学生命科学学院，长春 130118)

阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease,AD)是一种渐行性神经退行疾病，患者表现为记忆力减退、认知能力障碍、行为异常，最终将丧失独立生活能力，在发病后的10～20年因并发症死亡[1]。2018年，世界AD患者人数为5 000万，预计到2050年，世界患病人口数将达到15 200万[2]。然而目前没有任何一种药物能够有效地延缓AD的疾病进程[3]。研究表明，AD患者脑中有三大病理学特征：β淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)聚积形成的斑块、高度磷酸化的微管结合蛋白聚集形成神经元纤维缠结和神经元丢失[4]。其中，研究者普遍认为患者脑中Aβ含量的异常升高是导致AD发病的最主要原因。因此，利用免疫疗法清除脑中的Aβ是最具潜力治疗AD的手段。

Aβ被动免疫疗法是向体内输入Aβ特异性抗体，从而清除脑中过量的Aβ，以达到治疗AD的目的。很多药物研发公司进行了临床实验[5]。如辉瑞和强生公司研发的Bapineuzumab，礼来公司研发的Solanezumab，都是以Aβ为靶点的抗体，临床实验结果显示，应用Aβ特异性抗体能够减少患者脑中Aβ的沉积，并对轻度AD患者的认知功能有一定的改善[6-8]。而后，由百健公司开发的抗体BIIB037，在Ⅰ期临床试验中取得了较好的效果，目前正在准备进行Ⅲ期临床试验[9]；由百健和卫材公司一同研制的BAN2401，也在长达18个月的Ⅱ期临床试验中取得了较好的治疗效果[10]。这些实验结果都显示出了Aβ被动免疫疗法的治疗潜力。虽然Aβ被动免疫疗法已经取得了一定的治疗效果，但是由于全抗体存在抗体恒定区片段，易引发炎症反应，全抗体在AD治疗领域中的应用依旧存在安全性问题。

单链抗体(single chain fragment variable，scFv)是一种基因工程抗体，其只含有抗体重链以及轻链的可变区，并通过柔性铰链相连接[11]。对于AD的治疗，scFv显示出了极大的优势。首先，由于scFv相对分子质量较小，其能够更好地透过血脑屏障，显著提高治疗效果；此外，scFv能够更好地靠近脑中Aβ沉积，高效率地封闭Aβ的致病形式，有更高的治疗效率[12]。更重要的是，由于scFv不含有全抗体的恒定区结构，不能够引起补体反应，也不会激活脑中的免疫细胞，降低引起脑部炎症反应的可能，提高抗体治疗的安全性[13]。因此，单链抗体在AD治疗领域的应用，显示出了极大的优势。

本研究设计并成功制备了靶向Aβ的单链抗体，并对其体外活性进行了研究。结果显示，该单链抗体能够很好地与各种形式的Aβ相结合，具有良好的生物学活性，为AD的被动免疫疗法奠定了理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 单链抗体基因合成于生工生物工程(上海)股份有限公司；载体pET20b质粒、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)由吉林农业大学生命科学学院病原微生物与免疫团队提供；Aβ42多肽由上海吉尔生化合成；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶(TaKaRa公司)；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；镍柱柱料(GE公司)；6E10抗体(Covance公司)；Anti-His 单克隆抗体、AP 标记鼠二抗(Jackson Immuno Rearch 公司)；小牛血清、细胞培养基、胰酶(Hyclone 公司)；免疫组化试剂盒(迈新生物科技有限公司)；其他常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1scFv的表达与纯化 查找PDB数据库，获得能够识别Aβ3-7表位的抗体12B4(PDB ID:3IFP)的氨基酸序列，通过基因合成的方式，获得12B4-scFv的基因片段，并将其构建到pET20b表达质粒上，获得能够表达scFv的重组质粒pET20b-12B4-scFv。将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中，对scFv进行表达与纯化，获得单链抗体12B4-scFv。

1.2.2Aβ寡聚体与Aβ纤维的制备 将Aβ42多肽溶解于六氟异丙醇中，避光溶解至溶液澄清。在室温条件下将六氟异丙醇挥发完全。用DMSO将Aβ42多肽完全溶解后，加入F12培养基，涡旋形成多肽悬液。将多肽悬液在4℃ 孵育24 h 后，获得Aβ寡聚体；将多肽悬液在37℃ 孵育24 h后，获得Aβ纤维，样品置于-80℃ 冰箱备用。

1.2.3ELISA法检测scFv对不同聚集形式Aβ的结合活性 在ELISA板中包被Aβ42多肽单体、Aβ寡聚体以及Aβ纤维，每孔100 ng，4℃包被过夜。包被完成后，洗去包被物质，在37℃下封闭2 h。封闭后，将单链抗体从1∶1 000起，5倍稀释至1∶125 000，加入到孔板中，37℃ 孵育2 h。随后加入抗His单克隆抗体，37℃ 孵育2 h。然后进行二抗孵育与显色，并利用酶标仪检测结果。样品OD值高于背景值2倍视为阳性结果。

1.2.4Western blot法检测scFv对Aβ寡聚体形成的抑制作用 在上述制备Aβ寡聚体的过程中，加入scFv，4℃孵育24 h 后，收取样品，进行Western blot实验。首先利用SDS-PAGE对样品进行电泳分离，然后利用电泳半干转化仪，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。牛奶溶液封后，利用Aβ特异性抗体6E10抗体进行孵育，2 h 后，进行二抗与显色。

1.2.5硫黄素-T荧光法检测scFv对Aβ纤维形成的抑制作用 采用硫磺素T(THT)法检测scFv对Aβ纤维形成的抑制作用。将THT溶液加入到Aβ储备液中。并向其中加入纯化后的scFv，至总体积150 μl，混匀后加入孔板中。将孔板置于37℃中进行反应，每30 min利用荧光酶标仪对荧光进行检测，激发波长425 nm，发射波长460 nm，并绘制纤维生长曲线。

1.2.6MTT法检测scFv对Aβ寡聚体产生的细胞毒性的保护作用 将SH-SY5Y铺于 96 孔板中，每孔约 5×104个细胞。37℃培养24 h后，向孔中分别加入空培养基(阴性对照组)、寡聚体(实验对照组)或寡聚体和抗体混合物(实验组)。37℃孵育48 h 后，向孔板中加入MTT，37℃ 孵育4 h。然后将孔板离心后弃去孔中上清。向每孔加入150 μl DMSO，充分振荡混匀后，用酶标仪在490 nm处检测吸光度。

1.2.7免疫组化法检测scFv对AD模型小鼠脑中Aβ斑块的结合能力 取9月龄 APP/PS1 AD模型小鼠大脑，多聚甲醛固定后，脱水、透蜡、并进行石蜡包埋与切片。将切片进行高压抗原修复后封闭，以12B4-scFv为一抗进行孵育，然后以anti-His单克隆抗体为二抗进行孵育，滴加适量酶标抗体于切片上，孵育后显色。复染、脱水、透明后封片，镜检照相。

1.3统计学处理 采用SPSS统计软件对数据进行分析，组间比较采用t-Test分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1scFv的构建、表达与纯化 我们成功将12B4-scFv的基因序列构建到pET20b质粒上，并用大肠杆菌对12B4-scFv进行表达。利用镍柱亲和层析法，对scFv进行了纯化。实验结果表明，12B4-scFv能够很好地表达，经过纯化，能够获得纯度达95%以上的蛋白。12B4-scFv的SDS-PAGE与Anti-his Western blot结果如图1 所示。

2.2scFv能够与不同聚集形式Aβ相结合 我们通过ELISA的方式对纯化所得12B4-scFv与Aβ多肽、Aβ寡聚体以及Aβ纤维的结合活性进行了检测，结果如图2所示。12B4-scFv能够很好地与3种不同形式的Aβ相结合，其效价能够达到105。其中，抗体与Aβ多肽的结合能力最强，与Aβ纤维的结合能力最弱。这可能是由于12B4-scFv识别的是Aβ3-7，Aβ在聚集形成寡聚体或者纤维后，其N端暴露部分减少，导致抗体的结合能力减弱。

2.3scFv对Aβ寡聚体和纤维的形成具有抑制作用 我们首先通过Western blot 的方式检测了制备Aβ寡聚体，其分子量大小约为16 kD。在寡聚体制备过程中，加入12B4-scFv共同孵育，能够显著减少Aβ寡聚体的含量(图3A)。

图1 12B4-scFv的表达纯化图Fig.1 Purification of 12B4-scFv

THT能够与β折叠结构相结合，在激发光存在的情况下，发出荧光。在Aβ形成纤维的过程中，会产生大量β折叠结构，因此Aβ纤维能够与THT结合，并通过检测荧光的强度来检测Aβ纤维的形成情况。我们在制备Aβ纤维的过程中，加入12B4-scFv，检测抗体对Aβ纤维形成的抑制作用。实验结果如图3B所示，12B4-scFv的加入能够抑制Aβ纤维的形成，减少Aβ纤维的生成量，并能够减慢Aβ纤维形成的速率，与未加入抗体的对照组相比，差异具有显著统计学意义(P<0.001)。

2.4scFv对Aβ寡聚体产生的细胞毒性起到保护作用 我们利用SH-SY5Y细胞为模型，通过MTT法检测了Aβ寡聚体对PC12细胞的毒性以及12B4-scFv对细胞的保护作用。实验结果如图4所示。与对照组相比，12B4-scFv能够抑制Aβ寡聚体产生的细胞毒性，12B4-scFv的加入可以有效地保护细胞，当加入抗体的量为0.1 mol/L时，其对细胞的保护效率能够达到50%(P<0.01)。

图2 ELISA法检测12B4-scFv与不同形式Aβ的结合活性Fig.2 ELISA assay to determine binding activity of 12B4-scFv to different forms of Aβ

图3 12B4-scFv对Aβ寡聚体与纤维形成的抑制作用Fig.3 Inhibition on formation of Aβ oligomers and fibers by 12B4-scFvNote:A.Western blot assay to determine the inhibitory effect of 12B4-scFv against the formation of Aβ oligomer;B.THT method was used to detect the inhibition of 12B4-scFv on the formation of Aβ fibers.

图4 12B4-scFv对Aβ寡聚体产生的细胞毒性的保护作用Fig.4 Protective effect of 12B4-scFv on cytotoxicity induced by Aβ oligomerNote:**.P<0.01.

图5 12B4-scFv与AD模型鼠脑中Aβ斑块的结合作用Fig.5 12B4-scFv bind to Aβ plaques in brain of AD model mice

2.5scFv能够与AD模型小鼠脑中Aβ斑块结合 我们取9月龄 APP/PS1 AD模型小鼠的脑组织，并制备组织切片。以12B4-scFv为一抗，anti-His单克隆抗体为二抗，进行免疫组化实验。结果如图5所示。12B4-scFv能够与AD模型鼠脑中海马区Aβ斑块相结合，具有治疗潜力。

3 讨论

AD的发病机制复杂且至今未明确，目前尚无一种有效的治疗手段能够延缓AD的疾病进程[3]。淀粉级联假说指出，Aβ在脑中的异常分泌和产生过多，使其在脑组织内沉积，对周围的突触和神经元具有毒性作用，可破坏突触膜，最终引起神经细胞死亡[14]。Aβ的沉积还会导致AD的其他病理变化，如微管结合蛋白的过度磷酸化等，是AD发病的核心环节[15]。减少Aβ的形成，抑制Aβ的沉积，是最可能治疗AD的有效途径。

在过去的十几年中，Aβ免疫疗法逐渐发展起来。AN1792是第一个进入临床的AD主动免疫疗法，其以全长的Aβ42为免疫原进行了临床试验，但不幸的是这种主动免疫会引起T细胞免疫反应，导致6%的受试者产生了脑膜脑炎反应，最终该临床实验因安全性问题而失败[16]。虽然临床试验以失败告终，但结果显示，相比于对照组，Aβ的免疫治疗能够减少患者脑中Aβ沉积，并改善生活障碍。因此，如果能够避免主动免疫的副作用，Aβ免疫疗法依旧充满希望[17，18]。此后，以Aβ为靶点的被动免疫疗法发展起来，直接向人体注射靶向不同Aβ形式的抗体，具有靶点精确，起效快速，副作用小等特点。很多以Aβ为靶点的被动免疫疗法进入了临床试验，并取得了一定的治疗效果[19]。但是由于全抗体存在抗体恒定区片段，易引发炎症反应，并且具有分子量较大、血脑屏障透过率低等缺点，其在AD的治疗领域中的应用依旧存在安全性与有效性的问题。scFv由于其分子量小，不含有恒定区片段，大大增加了抗体治疗的安全性与有效性，成为AD被动免疫治疗的新方向[20]。

本研究在Aβ免疫疗法的基础上，对靶向Aβ3-7的抗体12B4进行了改造，成功表达纯化了其12B4-scFv。该scFv能够与Aβ单体、寡聚体、纤维很好地结合，并能够有效抑制Aβ寡聚体与纤维的形成。此外，该scFv还能抑制Aβ寡聚体产生的细胞毒性，能够与AD模型鼠脑中产生的斑块相结合，具有非常好的体外活性。12B4-scFv避免了Aβ免疫疗法目前存在的安全性与有效性的问题。此外，其体外功能的研究更揭示了抗体清除体内Aβ的作用机制。在下一步的实验中，我们将会利用12B4-scFv对不同年龄段的AD模型鼠进行治疗，进一步探究12B4-scFv对AD模型小鼠的神经保护作用，为阿尔茨海默症的新型抗体疗法奠定基础。