鸡软骨肽化学结构特征及抗氧化、抗炎活性成分研究

尹西拳 梁 明 胡明华 罗 丹 丁刘刚 林晓亮 刘 卫②

(无限极(中国)有限公司，广州 510663)

鸡软骨肽，是以动物鸡(Gallus gallus)的胸软骨为原料，通过生物可控的酶解技术制备而得的多肽混合物。鸡软骨肽中富含关节软骨所需的Ⅱ型胶原蛋白、硫酸软骨素以及其他活性多肽，其对关节炎、骨质疏松症等关节和骨骼的退行性疾病具有防治作用[1，2]。有报道指出胶原蛋白肽可通过多种途径发挥关节保护作用[3]，如：刺激关节软骨产生Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、黏多糖、蛋白多糖等活性物质发挥修复作用；增加成骨细胞的数量和分化；减少破骨细胞介导的骨吸收等。 其次鸡软骨中的硫酸软骨素作为结缔组织天然存在的重要成分，与胶原蛋白一起发挥关节保护作用[4，5]。目前关于鸡软骨肽发挥关节保护作用的物质基础研究报道较少，本实验借助LC-MS/MS以及物种蛋白质数据库对鸡软骨肽化学组成及抗氧化、抗炎活性成分进行研究，相关成果将为鸡软骨肽在保健食品及药品中的应用提供方法学和实验数据支持。

1 材料与方法

1.1材料 鸡软骨肽，以鸡胸软骨为原料，通过生物可控的酶解技术制备而得的多肽混合物，采用凯氏定氮法测得其蛋白含量为73.7%；合成多肽由合肥国肽生物科技有限公司合成并提供；ANT-300全自动定氮仪(上海洪纪仪器设备有限公司)；ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Q Exactive质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；多标记酶标仪(美国Perkin Elmer公司)；IL-1β试剂盒、PGE2 试剂盒、TNF-α试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；C518大鼠膝关节软骨细胞由实验室培养，培养条件为DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2。

1.2实验方法

1.2.1氨基酸组成分析 采用异硫氰酸苯酯(PITC)-柱前衍生高效液相色谱法检测鸡软骨肽水解后所得氨基酸的组成，结合文献报道[6-10]，鸡的氨基酸组成主要包括16种氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸)，羟脯氨酸和羟赖氨酸分别是软骨中胶原蛋白的重要成分之一，因此本实验以上述18种氨基酸作为标准品。具体方法如下：分别称取适量上述十八种氨基酸对照品，用0.1 mol/L的稀盐酸溶解，配成浓度为50 μg/ml的氨基酸标准品溶液。分别吸取适量十八种氨基酸标准品溶液，混合均匀，得氨基酸标准品混合液。称取0.1 g鸡软骨肽样品，加入0.5%苯酚的50%的盐酸4 ml，于安瓿瓶中熔封，150℃加热1 h，过滤，挥干溶剂，再加入5 ml 0.1 mol/L的稀盐酸溶解，得鸡软骨肽样品溶液。

吸取200 μl十八种氨基酸标准溶液(或样品溶液)于1.5 ml EP管中，再加入100 μl三乙胺溶液和100 μl PITC溶液，混合均匀后，于40℃水浴条件下反应1 h后，加入400 μl正己烷，涡旋振荡后静置30 min，取下相200 μl加800 μl水混匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。所有供试品溶液将采用以下条件进行HPLC分析[氨基酸专用柱Sepax AAA4.6×250 mm，5 μm；流动相A：0.1 mol/L醋酸铵(pH6.5)∶乙腈=93∶7；流动相B ：80%乙腈水溶液；柱温：36℃；流速：1.0 min；检测波长：245 nm；进样量：10 μl]。

1.2.2氨基酸测序 称量鸡软骨肽样品适量，加入离子水使其完全溶解，并使样品溶液浓度为100 mg/ml。样品溶液采用 C18 小柱进行除盐，具体操作如下：C18小柱依次加入 1 ml 100%乙腈溶液、1 ml 0.1%的 TFA 溶液，然后加入1 ml样品溶液，控制流速，使溶液缓慢流出，重复一次；加入 800 μl 0.1%的 TFA，重复一次；加入 500 μl的洗脱液(50%CAN，0.1%TFA)，并收集流出溶液，重复一次，合并溶液。所得流出液即鸡软骨肽洗脱液，冻干，样品保存在-20℃冰箱待用。

冻干样品用800 μl 0.1%甲酸溶液溶解，9 000 r/min离心10 min，取上清15 μl于进样瓶中进行液质联用(LC-MS/MS)分析。液相为ACQUITY UPLC (waters)，进样1 μl，色谱柱为C18，3 μm，250 mm×75 μm(Eksigent)。60 min色谱梯度，3.0 μl/min的色谱流速，1张MS谱中选10个强度最高的离子进行MS/MS分析，质谱分析在Q Exactive(thermo)上进行。

获得鸡软骨肽MS/MS离子碎片峰信息后，将所得质谱数据在NCBI物种 (Gallus gallus)蛋白质数据库中进行搜库检索，搜库条件：串联质谱检索(MS/MS Ion Search)；Trypsin酶切；M氧化和碘乙酰胺烷基化为可变修饰；漏切位点为1；Peptide质量误差为±10 ppm；Fragment质量误差为±0.05 Da。搜库检索后，利用MASCOT软件打分，选择卡值 ion score>35的鸡软骨肽多肽片段(大于35分即成功鉴定，可靠性达到显著水平)，即为鸡软骨肽代表肽段。

1.2.3鸡软骨肽代表肽段体外抗氧化能力评价 对鸡软骨肽代表肽段采取固相合成的方法进行制备，使各多肽纯度达到95%以上，冻干保存。

①DPPH法测定鸡软骨肽代表肽段抗氧化能力：以蒸馏水、5%的DMSO溶液为空白对照，分别取蒸馏水、5%DMSO、样品溶液150 μl，加入0.2 mmol/L的DPPH溶液150 μl，涡旋混匀后，于暗处反应90 min，即得供试品溶液。用紫外分光光度计在517 nm测定其吸光度，并计算各样品DPPH清除率。DPPH清除率(%)=1-Ax/A0×100%Ax表示样品在517 nm处的吸光度，A0表示空白对照组在517 nm处的吸光度。②水杨酸法测定鸡软骨肽代表肽段清除羟基自由基的能力 以蒸馏水、5%的DMSO溶液为空白对照，分别取蒸馏水、5% DMSO、样品溶液(4 mg/ml)50 μl，加入4 mmol/L FeSO4溶液50 μl，4 mmol/L 水杨酸无水乙醇溶液50 μl，混合摇匀，放置10 min后，再向其中加入4 mmol/L H2O2溶液50 μl，混合摇匀，在37℃条件下反应20 min后，即得供试品溶液。用紫外分光光度计在510 nm处测定各溶液吸光度，并计算各样品对羟基自由基的清除率。羟基自由基清除率(%)=1-Ax/A0×100%。Ax表示样品在510 nm处的吸光度，A0表示空白对照组在510 nm处的吸光度。③FRAP方法测定鸡软骨肽代表肽段总抗氧化能力 取FeSO4标准溶液/样品溶液(4 mg/ml)100 μl，分别加入1 ml新鲜配制的TPTZ工作液，混合摇匀，在37℃反应10 min后，紫外分光光度计于593 nm测定其吸光度，计算标准溶液线性方程，样品溶液吸光度代入方程并计算结果。

样品总抗氧化能力以FeSO4标准溶液表示，FRAP表示为每1克样品相当于FeSO4的摩尔数(nmol/g)。

1.2.4鸡软骨肽代表肽段对H2O2致C518大鼠膝关节软骨细胞氧化损伤的保护作用评价 将C518大鼠膝关节软骨细胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培养基终止消化，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入DMEM完全培养基重悬细胞，再将C518 大鼠膝关节软骨细胞按3×104个/ml接种于96孔板，待细胞贴壁后，设置空白组、模型组(1.0 mmol/L H2O2)、候选代表肽组(1.0 mmol/L H2O2+1.0 mg/ml各候选代表肽)，培养24 h后加入CCK-8试剂10 μl，反应3 h后于450 nm测定各孔OD值。

1.2.5鸡软骨肽代表肽段对LPS诱导的C518大鼠膝关节软骨细胞炎症模型的抗炎作用评价 采用体外脂多糖(LPS)刺激C518大鼠膝关节软骨细胞建立炎症模型，并给予鸡软骨肽代表肽段进行干预，观察C518细胞分泌的相关炎症因子的变化，以此对鸡软骨肽代表肽段抗炎活性进行评价。

将C518大鼠膝关节软骨细胞用1 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液消化40 s后，加入DMEM完全培养基终止消化，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入DMEM完全培养基重悬细胞，再将C518 大鼠膝关节软骨细胞按1×105个/ml接种于96孔板中，待细胞贴壁后，设置空白组、模型组(10 μg/ml LPS)、鸡软骨肽代表肽段组(10 μg/ml LPS+1.0 mg/ml各鸡软骨肽代表肽段)，培养24 h后，收集培养基上清液(-20℃保存备用)，分别测定上清液中IL-1β、PGE2、TNF-α 3种炎症因子的含量。

1.3统计学处理 用SPSS16.0 软件进行实验数据的统计学分析，两两比较用独立的t检验，P<0.05认为差异存在明显统计学意义。

2 结果

2.1氨基酸组成分析结果 通过对18种氨基酸混合液、水解鸡软骨肽样品的柱前衍生HPLC检测结果进行峰面积占比计算，获得18种氨基酸在鸡软骨肽中的占比情况，结果见图1。其中占比最高的是甘氨酸(G)29.5%，其次为脯氨酸(P)11.63%、丙氨酸(A)10.61%、谷氨酸(E)9.2%。

图1 鸡软骨肽氨基酸组成

表1 鸡软骨肽代表肽段氨基酸序列及分子量

Tab.1 Amino acid sequence and molecular weight of chicken cartilage peptides

No.AbbreviationSequenceMW(Da)1G1VAIQAVLSLYASGR1 446.822G2SYELPDGQVITIGNER1 789.893G3ESYVETELIFALAK1 611.844G4MEGNAEESTLFCFAVRG1 859.825G5IAEEFEVELER1 362.676G6GPRGPPGPVGP986.537G7FFWEMAEEEGWIR1 728.768G8GRPGPPGPVGP986.539G9MPSPLPRS883.4610G10ELSDSSDGLEVK1 277.6011G11GPAGPSGPR794.40

2.2氨基酸测序结果 对鸡软骨肽质谱数据进行NCBI物种蛋白数据库搜库检索后，共得到3 077条肽段，选择MASCOT软件打分，在卡值 ion score>35的条件下，共确定11个鸡软骨肽代表肽段，氨基酸序列和分子量信息见表1。

2.3鸡软骨肽代表肽段体外抗氧化能力评价结果 结果见图2、3。在DPPH清除率方面，G4、G3、G2、G1活性最强；在OH·清除率方面，G4、G5、G10、G7活性最强；在FRAP总抗氧化能力方面，G3、G1、G2活性最强。对11条多肽分别按照DPPH清除率、OH·清除率、FRAP检测数据大小进行排序，获得综合抗氧化能力强弱排序为G4、G3、G2、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8。

2.4鸡软骨肽代表肽段对H2O2致C518大鼠膝关节软骨细胞氧化损伤的保护作用评价结果 结果见图4。经浓度为1 mmol/L的H2O2溶液处理后，模型组细胞损伤率达到69.7%，与空白组相比，有极显著性差异，表明此次造模成功。各代表肽组与模型组相比，均存在极显著差异，说明候选的11条代表肽都能不同程度抵抗H2O2对C518细胞造成的氧化性损伤，且效果明显。在候选代表肽中，对C518细胞氧化损伤保护作用较强的肽段依次为G10、G1、G4、G9、G11等代表肽段。

图2 鸡软骨肽代表肽段的抗氧化能力(DPPH清除率、OH·清除率)

图3 鸡软骨肽代表肽段抗氧化能力评价(FRAP value)

2.5鸡软骨肽代表肽段对LPS诱导的C518大鼠膝关节软骨细胞炎症模型的抗炎作用评价结果 结果见图5。在11条鸡软骨肽代表肽段中，只有G4能够显著降低IL-1β水平(P<0.05)，其余无显著性差异；G1、G2、G9能够显著降低PGE2水平(P<0.05)，其余无显著性差异；G4、 G1、G3、G5、G6、G7、G9、G10、G11能够显著降低TNF-α水平(P<0.05)，其中G4组效果最为明显(P<0.01)。综合来看，G4抗炎效果最优，其次为G1、G9、G7。

图4 鸡软骨肽代表肽段对H2O2致C518大鼠膝关节软骨细胞氧化损伤的影响(以OD值计)

图5 鸡软骨肽代表肽段对LPS诱导的C518大鼠膝关节软骨细胞炎症模型的抗炎作用

3 讨论

本实验发现鸡软骨肽的氨基酸组成以甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、谷氨酸(Q)为主，占比超过60%，与吴雷等[8]报道的检测结果基本一致[9，10]。但由于本实验所用原料为鸡软骨酶解混合多肽，并未进行胶原蛋白的纯化，其羟脯氨酸占比偏低。将鸡软骨肽氨基酸组成与鉴定出的11条鸡软骨肽肽段进行对比可知，G2(SYELPDGQVITI-GNER)、G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)、G6(GPRGPPGPVGP)、G8(GRPGPPGPVGP)、G11(GPAGPS-GPR)等五个肽段的氨基酸组成与鸡软骨肽的整体氨基酸组成相似度相对较高。

进一步对鸡软骨肽代表肽段抗氧化、抗炎作用分析发现，DPPH清除率、OH·清除率、FRAP三个指标的抗氧化综合能力强弱排序为G3、G2、G4、G1、G10、G5、G11、G7、G6、G9、G8，对H2O2致C518细胞氧化损伤保护作用较强的肽段依次为G10、G1、G4、G9、G11，对LPS诱导的C518大鼠膝关节软骨细胞的抗炎作用较强的肽段依次为G4、G1、G9、G7。综合抗氧化、抗炎作用评价结果，可知G4综合功效最佳，其次为G1。而G4的氨基酸组成与鸡软骨肽的整体氨基酸组成相似度相对较高，推测G4(MEGNAEESTLFCFAVRG)可能是鸡软骨肽的主要活性片段之一。

综上所述，本实验在确定鸡软骨肽氨基酸组成的基础上，进一步借助LC-MS/MS以及物种蛋白质数据库鉴定出11个氨基酸序列清晰、分子量明确的鸡软骨肽代表肽段，并确定了多条抗氧化、抗炎活性显著的鸡软骨肽代表肽段。本实验是对于鸡软骨肽化学结构特征及功效的初步探索研究，相关研究成果将为鸡软骨肽在保健食品及药品中的应用提供方法学和实验数据支持。未来还可通过对鸡软骨肽进行纯化，并结合蛋白质测序等更精准的检测方法，深入开展化学结构特征研究。