一株植物乳杆菌的抑菌物质性质研究及抑菌条件优化

姚沛琳 张凯迪 张新剑 韩盼盼

摘 要：以传统发酵食品为筛选源，获得50株乳酸菌，采用牛津杯方法筛选出一株抑菌性能较好的植物乳杆菌7-1，抑菌圈直径为15.24mm，并且边缘清晰.然后对植物乳杆菌7-1的抑菌物质进行性质研究和抑菌条件优化，为天然生物防腐剂的研究提供参考.结果表明：该菌产生的细菌素，热稳定性良好，在酸性条件下保持较高抑菌活性，经蛋白酶处理后抑菌活性几乎丧失.采用单因素正交实验对该菌产细菌素条件进行优化，结果为：葡萄糖为碳源、培养基初始pH为7、培养时间为36h，抑菌圈直径为19.6mm，边缘清晰.这一结果为天然生物防腐剂的研究提供了一个新的菌株和参考，丰富了天然生物防腐剂研究文库.

关键词：乳酸菌;分离鉴定;抑菌;优化

中图分类号：TS202.3  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）01-0070-04

乳酸菌是一类可以通过利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的革兰氏染色阳性细菌[1]，在自然界中分布十分广泛[2].因其具有很好的益生作用，被广泛应用于食品等与人类相关的产业.

乳酸菌能够抑制腐败菌和病原菌的生长，从而达到防止腐败变质、延长保质期的作用[3-4].因此，乳酸菌被公认为是最具有潜在开发价值的天然生物防腐剂[5-7].经研究发现，乳酸菌在代谢过程中可产生多种抑菌物质.其产生的酸性物质可显著降低环境的pH值和Eh（氧化还原电位）值，让环境保持酸性，从而对致病菌产生拮抗作用，以达到抑菌目的[8].其产生的过氧化氢因为没有过氧化氢酶的存在，从而可以在食物环境中不断积累，进而对其他微生物产生抑制作用[9].在这些抑菌物质中起主要作用的是一种被称为细菌素的物质.细菌素是由某些细菌在代谢过程中经核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质类物质[10-11].因为细菌素具有强抑菌性且无抗药性，完全弥补了传统抗生素的缺陷，因此被认为是“抗生素的理想替代品”，得到人们的广泛关注.

随着人们对食品安全的关注以及抗生素的滥用产生的抗性，人们一直在努力寻找一种可以代替抗生素的安全有效的天然生物防腐剂.而乳酸菌细菌素作为抑菌物质掺入食品系统已经被广泛研究，且其在食品中的安全性和有效性已经得到反复验证[12-13].如果可以筛选出一株抑菌性能较好的乳酸菌，将对天然防腐剂的研发起到积极作用.因此，本实验首先筛选对大肠杆菌抑菌作用较强的乳酸菌，然后研究其抑菌物质性质以及优化抑菌物质的产生条件，为天然生物防腐剂的研究提供一定的理论参考.

1 材料方法

1.1 实验菌株

乳酸菌来源：从皖南、皖北等地区自家腌制菜中筛选得到.

大肠杆菌ATCC25922，由学院实验室提供.

1.2 设备及试剂

主要设备：SHP—250型电热恒温培養箱（上海三发科学仪器有限公司）;1-15PK离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）;722型可见光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）;phs-25型PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）.

主要试剂：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖等化学试剂，均购置于国药集团.

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的分离与纯化

从皖南、皖北等地区获得的家庭自制腌制菜的汁液中分离乳酸菌菌株.无菌操作取样品1mL，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择合适的梯度，涂布于MRS固体培养基上，置于37℃恒温培养培养48h.挑取典型菌落，多次划线后得到纯菌株.将得到的纯菌株进行革兰氏染色、菌落形态观察、接触酶实验等系列实验，确定为乳酸菌后用甘油保藏在-80℃的冰箱里[14].

1.3.2 体外抑菌实验

采用牛津杯琼脂扩散法[15].将过夜培养的乳酸菌菌液接种到MRS液体培养基中，37℃条件下培养20h，再在4℃，12000rpm/min下离心20min，过滤除菌，得到乳酸菌无细胞发酵上清液.将过夜培养的大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃摇床培养12h，调节OD至0.3，菌落数约在1×108cfu/mL左右.取大肠杆菌菌悬液1mL，与LB固体培养基混合凝固后，将灭过菌的牛津杯放置在培养皿上.再往牛津杯里添加200μL乳酸菌无细胞发酵上清液，将此平板正面静置于37℃恒温培养箱中培养，48h后测量抑菌圈大小.

1.3.3 乳酸菌抑菌物质的性质研究

1.3.3.1 抑菌物质的热稳定性试验

将过夜培养的乳酸菌接种到MRS液体培养基中，37℃培养20h，在4℃和12000rpm/min条件下离心20min，过滤除菌，得到乳酸菌无细胞发酵上清液.将此上清液分别在37℃、60℃、80℃、90℃、100℃的水浴锅中处理30min，对照组置于4℃冰箱保存30min，检测其抑菌活性[16].

1.3.3.2 抑菌物质的pH稳定性试验

取等量乳酸菌发酵上清液6份，调节pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，过滤除菌，然后检测其抑菌活性[16].

1.3.3.3 抑菌物质的蛋白酶敏感性试验

取等量乳酸菌上清液2份，调节pH值分别至两种酶液的最适pH（胰蛋白酶为7.4、木瓜蛋白酶为6.0），对照组为原始菌液，再分别加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理60min（蛋白酶浓度为1.0mg/mL），调pH为初始值，过滤除菌，然后检测其抑菌活性[16].

1.3.4 乳酸菌抑菌条件优化的单因素试验

1.3.4.1 不同培养时间对抑菌能力的影响

培养基的初始pH为6.2，碳源为葡萄糖，将接好菌的培养基分别培养12h、18h、24h、36h、48h.通过体外抑菌实验测定不同培养时间抑菌圈的大小，以此来确定最佳培养时间.

1.3.4.2 不同碳源对抑菌能力的影响

培养基的初始pH为6.2，培养时间为24h.以葡萄糖、乳糖、蔗糖、低聚果糖、低聚半乳糖分别作为培养基中的唯一碳源进行培养.同样根据抑菌圈直径大小来确定最佳碳源[17-18].

1.3.4.3 培养基初始pH对抑菌能力的影响

培养时间为24h，碳源为葡萄糖，取等量的MRS液体培养基5份，初始pH值分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，检测抑菌活性，根据抑菌圈大小选定最合适的初始pH.

1.3.5 乳酸菌抑菌条件优化的正交试验

根据单因素试验结果，每个因素选择三个较优水平，以抑菌圈大小为指标，进行L9（34）正交实验，最后对实验结果进行整理分析从而得到最佳的抑菌条件.

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌体外抑菌实验结果

采用纯培养方法从不同来源的腌制菜中分离出50株乳酸菌，以大肠杆菌为指示菌，对其进行体外抑菌实验，实验结果见表1.由表1可知，大多数乳酸菌对大肠杆菌都有不同程度的抑制能力.经过综合评定选择菌株7-1为研究对象，经细菌16S rDNA鉴定为植物乳杆菌.

2.2 乳酸菌产抑菌物质的性质研究结果

2.2.1 抑菌物质的热稳定性

乳酸菌抑菌物质的热稳定性结果如图1所示.由图1可知，乳酸菌抑菌物质的热稳定性在研究范围内是比较好的.随着温度的增加，出现先缓慢增加后缓慢降低的趋势.植物乳杆菌7-1可以耐受100℃的高温，经过高温处理后，抑菌活性仅降低17.24%.结果表明，该菌产生的抑菌物质中起主要作用的不是大分子蛋白质.

2.2.2 pH对抑菌效果的影响

pH对植物乳杆菌7-1抑菌效果的影响结果见图2.由图2可知，植物乳杆菌7-1的抑菌效果随pH值的增大呈现先增后显著降低的趋势.当pH为4时抑菌活性最大;当pH在4-6时，抑菌活性显著下降;当pH在6-7时，抑菌活性剧烈下降直至失去活性.结果表明溶液的酸碱性对抑菌物质的抑菌活性影响很大，在酸性条件下抑菌活性强，在中性及碱性条件下几乎失去活性，符合细菌素的性质.

2.2.3 抑菌物质的蛋白酶稳定性

植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质的蛋白酶稳定性结果如图3所示.结果表明，经过蛋白酶酶解之后，此抑菌物质的抑菌活性剧烈下降近乎失活，由此结果可以推断植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质主要为多肽类物质，而细菌素正符合这一性质[19]，故可以进一步判定植物乳杆菌7-1发酵上清液中的抑菌物质为细菌素，可以被蛋白酶降解，具有环境友好型特点.

综合图1、图2和图3结果可知，植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质初步可以判定为多肽类细菌素，具有良好的热稳定性，在酸性条件下抑菌活性较大，具有环境友好型等特点.

2.3 不同培養时间对抑菌效果的影响

抑菌物质大多数是微生物的次级代谢产物，不同的培养时间会对抑菌物质的产量产生影响从而影响抑菌效果.因此，为了探究植物乳杆菌7-1产抑菌物质的最佳培养时间，设置了培养时间梯度，结果如图4所示.抑菌效果随培养时间的延长先增大后降低，当培养时间为24h时，抑菌效果最好.微生物的次级代谢产物一般在稳定期会积累，这个结果说明植物乳杆菌7-1在24h时结束稳定期进入衰亡期，24h后抑菌效果下降可能是因为衰亡期的微生物与抑菌物质相互作用，影响了其活性.

2.4 不同碳源对抑菌效果的影响

在微生物的生长繁殖过程中，碳源作为重要的营养要素之一必不可少.因此，为了探究植物乳杆菌7-1的生长状态达到最佳时的碳源，研究了不同碳源对抑菌效果的影响，结果如图5所示，不同的碳源条件下产生的抑菌物质的抑菌性能各不相同，其中最好的碳源是低聚果糖，葡萄糖次之，低聚半乳糖最差，结果表明植物乳杆菌7-1可以更好地利用低聚果糖.

2.5 不同初始pH对抑菌效果的影响

培养基的酸碱性与微生物的生长繁殖有很大的关系，因此，为了探究植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质的抑菌活性最大时的培养基的初始pH，设置了不同初始pH，结果如图6所示.结果表明，植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质的抑菌活性随着初始pH的递增呈现先增大后减小的趋势，当pH为7时抑菌活性最大.当pH在6-7范围内时抑菌性变化不明显，而当培养基初始pH呈碱性时抑菌活性开始显著降低.通过这一结果可以进一步推断植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质应该是细菌素，由于培养基的碱性条件抑制或影响了细菌素的活性从而导致抑菌活性降低.

2.6 抑菌条件正交优化结果

以A（培养时间）、B（不同碳源）、C（初始pH）3因素，进行L9（34）正交实验，通过抑菌圈大小为评价指标，对抑菌条件进行优化从而得到最佳的抑菌条件.其正交因素水平表如表2所示，结果分析见表3.

由表3可知，影响植物乳杆菌7-1抑菌活性的三个因素的主次顺序依次为A（培养时间）>B（不同碳源）>C（初始pH），即培养时间对抑菌活性影响最大，其次为不同碳源的培养基，影响最小的是培养基的初始pH.根据极差分析可知，得到最大的抑菌活性对应的最优抑菌条件的组合为A3B1C3，即培养时间为36h、碳源为葡萄糖、初始pH为7.通过结果可知在这种组合下植物乳杆菌7-1的抑菌圈大小为19.6mm.

3 结论

本研究首先从不同来源的腌制菜中分离纯化出50株乳酸菌，然后根据体外抑菌实验从中筛选出一株抑菌效果最佳的植物乳杆菌7-1.对植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质的性质研究发现其可以耐受100℃的高温，在酸性条件下抑菌活性较大，可以被蛋白酶降解失去抑菌活性，初步判断该菌产生的抑菌物质主要为细菌素.抑菌条件优化的结果表明植物乳杆菌7-1的培养时间为36h、碳源为葡萄糖、培养基初始pH为7时可以得到最佳的抑菌活性.通过对植物乳杆菌7-1产生的抑菌物质的性质进行研究以及抑菌条件优化，丰富了天然生物防腐剂研究文库，为今后天然生物防腐剂的研究提供了一份参考.

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