复合真菌多糖体外抗氧化活性研究

王晴 曹稳根 钱玉梅 李红侠 翟科峰 陈红玲

摘 要：以黑木耳、银耳、香菇为材料，采用超声波辅助水提法制备三种真菌多糖，并按等体积比制备复合真菌多糖，通过比较对DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察復合真菌多糖与单一真菌多糖抗氧化活性强弱.结果表明：复合真菌多糖对DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基清除作用高于黑木耳多糖、银耳多糖、香菇多糖，呈现协同作用，为真菌多糖的高效利用及复合真菌多糖的进一步开发应用提供理论依据.

关键词：多糖;复合;真菌;抗氧化

中图分类号：S646  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）01-0063-03

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体或其发酵液中提取得到，主链由β-D型葡萄糖基连接而成，人体必不可少的一种高分子活性聚合物[1].目前国内外研究表明，真菌多糖可发挥多种功能：改变细胞膜成分、影响细胞信号传递、诱导细胞凋亡和分化等来抵御、预防肿瘤威胁，发挥抗肿瘤作用[2];激活巨噬细胞、活化淋巴细胞以及加强某些细胞因子等，提高机体免疫力[3];与自由基结合、形成抑制物阻止氧化、促进抗氧化酶生成以及提高抗氧化酶活性，具有抗氧化能力等[4].真菌多糖的相关研究正在火热进行，从真菌多糖的生理学功能、应用领域到如何合理制备来提高其生理活性，其中关于复合真菌多糖的优异性已经受到各界学者的重视.于冲等人[5]将五种不同的真菌多糖按不同比例复合后，通过测定两种抗氧化指标，结果表明复合后的真菌多糖清除自由基的效果更佳，基本呈现协同增长，由此可见复合真菌多糖具有较好的开发及应用前景.

以黑木耳、银耳、香菇为原料，采用超声辅助水提法制备三种真菌多糖，按等体积比混合得到复合真菌多糖，通过比较对DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用，考察复合真菌多糖与单一真菌多糖抗氧化活性强弱，为复合真菌多糖进一步研究和应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验材料木耳、银耳、香菇均为市售;试验试剂葡萄糖、苯酚、水杨酸、焦性没食子酸、硫酸均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司;DPPH购于上海源叶生物科技有限公司;ABTS购于合肥巴斯夫生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯.

1.2 试验仪器

DHG-9030A型鼓风干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）;XL-04B中草药粉碎机（广州旭众食品机械有限公司）;JY96-IIN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;SHZ-D（III）循环水式多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）;R-1001LN旋转蒸发仪（郑州长城科工有限公司）;SC-3612低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）等.

1.3 试验方法

1.3.1 真菌预处理

分别将木耳、银耳、香菇洗净、剪碎，置于50℃干燥箱中干燥6h，粉碎，过80目筛，按料液比1：20（g/mL）加入90%乙醇，浸提过夜，2700g下离心15min，弃上清液并将残渣自然风干后分别得木耳、银耳、香菇预处理粉末.

1.3.2 真菌多糖提取

分别取木耳、银耳和香菇预处理粉末3g，按料液比1：30（g/mL）加入蒸馏水，在超声功率580W，超声时间1h条件下超声提取，2700g离心15min，取上清，浓缩，抽滤，定容至100mL，分别得木耳、银耳、香菇多糖提取液[6].

1.3.3 真菌多糖浓度及得率测定

按廖彭莹等[7]的方法绘制葡萄糖标准曲线，分别取木耳、银耳、香菇多糖提取液稀释至适宜倍数，按制作葡萄糖标准曲线的方法，测定吸光值，根据标准曲线及稀释倍数计算得到提取液多糖浓度，并按下式计算银耳、木耳、香菇多糖得率：

真菌多糖得率（%）=（c×n×V/m）×100

式中c为由标准曲线计算得到的稀释后的真菌多糖浓度，mg/mL;n为真菌多糖提取液稀释倍数;V为真菌多糖提取液总体积，mL;m为真菌质量，g.

1.3.4 复合真菌多糖的制备及抗氧化能力测定

将木耳、银耳、香菇多糖提取液按等体积比（1：1：1）混合，摇匀，制备浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的复合真菌多糖，按王金玺的方法测定复合真菌多糖及与其相同浓度的木耳多糖、银耳多糖、香菇多糖对DPPH自由基清除率[8];制备浓度分别为1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的复合真菌多糖，按刘丹丹[9]和许女[10]的方法测定复合真菌多糖及与其相同浓度的木耳多糖、银耳多糖、香菇多糖对·OH自由基清除率;制备浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的复合真菌多糖，按段笑影等的方法测定复合真菌多糖及与其相同浓度的木耳多糖、银耳多糖、香菇多糖对O2-·自由基清除率[11];制备浓度分别为1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的复合真菌多糖，按杨卓等的方法测定复合真菌多糖及与其相同浓度的木耳多糖、银耳多糖、香菇多糖对定ABTS+自由基清除率[12].

2 结果与分析

2.1 真菌多糖浓度及得率

超声波是一种高频率机械波，能够通过超声空化作用向受作用体系提供高能量，从而加速真菌多糖的溶出，此外，超声波的次级效应如机械振动、击碎、扩散、乳化、化学效应等也能加速多糖的扩散、释放并使之与溶剂充分混合，有利于多糖提取[13].由表1可知，在超声功率580W，超声时间1h的条件下，三种真菌多糖得率具有显著性差异（P<0.05），其中木耳多糖得率最高，银耳多糖次之，香菇多糖得率最低，可能由于超声波对不同真菌组织和细胞壁的破坏程度有所差异，对细胞膜穿透能力和多糖被动运输能力影响不同而造成.

2.2 复合真菌多糖对DPPH自由基清除作用

DPPH是一种氮中心自由基，对蛋白质、脂质、核酸等大分子具有攻击作用，从而引发机体病变[14].由图1可知，三种真菌多糖对DPPH自由基清除能力從大到小为：银耳多糖>木耳多糖>香菇多糖，但复合真菌多糖对DPPH自由基清除能力均高于任意单一多糖，且多糖浓度在0.1～0.5mg/mL时，清除率基本稳定在70%以上，随多糖浓度的升高清除率变化较小.

2.3 复合真菌多糖对？OH自由基清除作用

羟自由基是由过氧化氢释放出的氧化能力和毒性较强、较活泼的活性氧自由基，能够氧化机体内的蛋白质、脂质、核酸等生物大分子，造成人体组织中脂质的过氧化、核酸的断裂、多糖和蛋白质的分解，从而导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和癌变[15].由图2可知，当多糖浓度为1.0mg/mL时，木耳多糖、香菇多糖、银耳多糖对·OH自由基清除作用较低，清除率分别为23%、21.82%、22.38%，而复合真菌多糖清除率为48.68%.对·OH自由基清除作用大小为：复合真菌多糖>香菇多糖>银耳多糖>木耳多糖.

2.4 复合真菌多糖对O2-·自由基清除作用

超氧阴离子自由基是生命体代谢过程中产生的一种氧化能力较强的活性氧自由基，在机体中存在寿命最长，能引发体内脂质过氧化，加快机体衰老过程，并可诱发皮肤病变、心血管疾病、癌症等[16].图3表明，对O2-·自由基清除作用大小为：复合真菌多糖>香菇多糖>银耳多糖>木耳多糖，复合真菌多糖真高清除为最高达到80.42%.

2.5 复合真菌多糖对ABTS+自由基清除作用

ABTS在适宜条件下被氧化会生成稳定绿色的ABTS+，在734nm下有特征吸收峰，加入抗氧化物质会抑制绿色ABTS+自由基的生成，使颜色减弱.对ABTS+的清除能力能反映出抗氧化物质的抗氧化能力[14].图4表明，在多糖浓度为1.0～2.0mg/mL，复合真菌多糖对ABTS+清除作用均在90%以上，且高于其他三种单一真菌多糖，当多糖浓度为1.2mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL时，复合真菌多糖对ABTS+清除率清除作用甚至超过Vc.ABTS+自由基清除能力大小为：复合真菌多糖>香菇多糖>木耳多糖>银耳多糖.

3 结论与讨论

真菌多糖具有丰富的生物活性，并且无毒副作用，是当前最具开发潜力的功能性食品的新资源[17].自由基是共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团，化学性质极活泼，如果体内大量自由基存在，会与脱氧核糖核酸、蛋白质、脂质等生物大分子发生反应，造成器官、组织和细胞的功能衰退，引起一系列慢性疾病，并且加速衰老[18].大量研究表明，真菌多糖具有清除自由基作用，且不同真菌多糖的复合，其作用可互补和协同[19]，因此复合真菌多糖的抗氧化活性研究，在真菌多糖的开发与应用中具有重要的意义.

利用超声波辅助水提法制备木耳多糖、香菇多糖、银耳多糖，并按等体积比制备复合真菌多糖，通过对DPPH、·OH、O2-·、ABTS+自由基的清除作用的考察，得到复合真菌多糖对四种自由基清除能力均高于三种单一真菌多糖，呈现出协同作用，表明复合真菌多糖的抗氧化作用并非是真菌多糖成分的简单叠加，各种成分间存在着相辅相成、相互为用的关系，其相加、协同或拮抗作用不容忽视，且采用何种方式组合配伍能最大程度提高复合多糖活性至关重要，且具有巨大的经济价值，仍需进一步探索.

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