HPLC 法同时测定杜仲平压片中6 种成分

何 艳，胡小祥

（1.湘南学院药学院，湖南 郴州 423000； 2.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000）

杜仲平压片是由杜仲叶经水煎、浓缩所得浸膏加工制成的片剂，功效降血压、强筋健骨，适用于高血压、腰膝酸痛、筋骨痿软等症，临床用于治疗高血压和骨质疏松。杜仲叶有效物质主要包括绿原酸、咖啡酸等苯丙素类成分［1-2］，京尼平苷酸、京尼平苷等环烯醚萜类成分［3］，以及芦丁、槲皮素等黄酮类成分［4］，其中绿原酸具有利胆、抗菌、抗病毒、降压等多种药理作用［5-6］；咖啡酸对心脏和血管组织增生有明显抑制作用，可降低血浆中内皮素水平，对内皮素-1 引起的血压上升具有明显拮抗作用，从而降低血压［7］；京尼平苷酸能增殖造骨细胞，抗骨质疏松，降低血压［8］；芦丁具有广泛的生物活性，如降血压、降血脂、抗氧化、舒张血管等［9-10］。

然而，现行国家标准仅对杜仲平压片中绿原酸进行定性鉴别和定量测定［11-12］，尚未涉及其他活性成分，并且相关文献报道也较少［13］。因此，本实验采用HPLC 法同时测定杜仲平压片中京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁的含有量，以期为进一步完善该制剂质量控制方法提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置G1311B 四元泵、G1329B 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D DAD 检测器（美国Agilent Technologies 公司）；XSE-205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸（批号110753-201716，质量分数99.3%）、京尼平苷酸（批号111828-201604，质量分数 97.4%）、咖啡酸（批号110885-201716，质量分数99.7%）、芦丁（批号100080-201811，质量分数92.4%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸（批号18031001，质量分数99.67%）、隐绿原酸（批号18032403，质量分数99.07%）对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司。杜仲平压片（批号171510，西安阿房宫药业股份有限公司；批号20171101、20170603、20180102，贵州三仁堂药业有限公司）。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；磷酸、甲醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～15 min，5%～10%A；15～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%A；30～35 min，16%～30%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长238 nm（0～10 min）、324 nm（10～25 min）、354 nm（25～35 min）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品京尼平苷酸9.59 mg、新绿原酸10.34 mg、绿原酸15.28 mg、隐绿原酸10.56 mg、咖啡酸6.04 mg、芦 丁5.49 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取3、5、6、7、1、2 mL，置于同一25 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（含京尼平苷酸22.42 μg／mL、新绿原酸41.22 μg／mL、绿原酸72.83 μg／mL、隐绿原酸58.58 μg／mL、咖啡酸4.817 μg／mL、芦丁8.116 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取片剂适量，除去薄膜衣或糖衣，研细，取粉末约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，称定质量，超声（300 W、40 kHz）30 min，放冷，50% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按片剂处方工艺制得只含辅料的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离效果理想（分离度均大于1.5），阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、10、14 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定积。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁峰面积RSD 分别为0.14%、0.21%、0.23%、0.20%、0.25%、0.29%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号171510），于0、4、8、12、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁峰面积RSD 分别为1.42%、0.29%、0.30%、0.36%、0.70%、1.57%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批（批号171510）片剂6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁含有量RSD 分别为1.32%、0.86%、0.97、1.50%、0.89%、1.14%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取含有量已知的同一批（批号171510）片剂，除去薄膜衣或糖衣，研细，精密称取粉末约0.25 g，共6 份，置于锥形瓶中，精密加入50 mL 含京尼平苷酸（8.756 μg／mL）、新绿原酸（20.61 μg／mL）、绿原酸（30.37 μg／mL）、隐绿原酸（33.43 μg／mL）、咖啡酸（0.682 9 μg／mL）、芦丁（2.490 μg／mL）的50% 甲醇，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁平均加样回收率分别为99.51%、100.10%、100.34%、99.26%、99.01%、98.07%，RSD 分别为1.85%、1.19%、1.26%、1.96%、1.30%、1.03%。

2.9 样品含有量测定 取4 批片剂，每批3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长筛选 本实验采用DAD 检测器在200～400 nm 范围内进行全波长扫描，并采集光谱图。结果，京尼平苷酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁分别在238、326、326、326、324、354 nm 处有最大吸收，综合考虑各成分在供试品色谱图中的响应值，最终选择238 nm作为京尼平苷酸检测波长，324 nm 作为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸检测波长，354 nm 作为芦丁检测波长。

3.2 色谱条件筛选 本实验考察了Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），发现Thermo Hypersil Gold-C18色谱柱分离效果最好，色谱峰对称性理想。再考察了流动相乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5% 磷酸［14-15］，发现乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5%磷酸洗脱时各成分均达到较好的分离，而且两者效果基本一致，综合考虑成本和安全因素，选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。

3.3 提取方法筛选 本实验比较了提取溶剂乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇，发现50%甲醇提取时各成分提取率最高，色谱峰峰形最好，故选择其作为提取溶剂。再考察了超声时间20、30、40、50 min，发现超声30 min 时各成分提取基本完全，故确定其作为提取时间。

3.4 含有量分析 表3 显示，4 批杜仲平压片中各成分含有量差异较大，以京尼平苷酸最明显，其原因可能是不同批次原料药的差异所致，故生产厂家应对此加以关注。