可溶性生长刺激表达基因2 蛋白检测方法的研究进展

李登红，陆建伟，梁健嘉，王洪涛

1 巴迪泰（广西）生物科技有限公司 （广西南宁 530031）；2 广西中医药大学第一附属医院检验科 （广西南宁 530022）

生长刺激表达基因2蛋白（growth stimulation expressed gene 2，ST2）是于1989年由Tominaga[1]发现的，但直到2002年Weinberg等[2]报道其可以由心肌细胞在心肌应激时表达，才引起人们对其心血管作用的兴趣。ST2是白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）受体超家族的成员之一，包括4种亚型，即可溶性ST2（soluble ST2，sST2）、跨膜型ST2（growth stimulation expressed gene 2L，ST2L）、多变型ST2（growth stimulation expressed gene 2V，ST2V）及跨膜多变型ST2（growth stimulation expressed gene 2LV，ST2LV）。其中sST2、ST2L是心力衰竭的重要研究对象。2005年，Schmitz等证实白介素-33（IL-33）为ST2的功能性配体，IL-33/ST2L能够抗心肌纤维化，从而起到保护心脏的作用[3]。当心肌受到损伤时，sST2会在心肌细胞大量产生并作为“诱饵”受体与IL-33竞争性结合，导致IL-33/ST2L信号通路被切断，继而造成心肌纤维化，加速心肌重构等症状[4-6]。因此，选择一种快速、准确地检测sST2的方法对于心力衰竭患者的诊断、预后评估意义重大。

目前，临床检测sST2的主要方法为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。随着检测技术的发展，国外出现了分子印迹纳米粒子多重传感器分析技术、双色上转换纳米粒子荧光侧流分析技术及荧光免疫层析法等，而国内的荧光免疫方法发展迅速，出现了时间分辨荧光免疫分析法、循环增强荧光免疫法等检测方法。目前，国内外未见有关于sST2检验方法的综述，希望通过本研究的阐述，为sST2相关研究者提供一些思路。

1 检测方法

1.1 ELISA 法

ELISA法以免疫酶技术为基础，目前在临床检测上应用广泛，技术成熟[7]。虽然该技术在检测时间、操作等方面存在弊端，但其在灵敏度、特异度、酶标记物稳定性、试剂价格等方面占有优势。ELISA法的分析物可在室温下保持48 h稳定，在4 ℃下稳定7 d，在-20 ℃和-80 ℃下稳定至少2个月[8]。这种方法符合实验室医学质量规范的要求，因此也被美国食品和药物管理局推荐用于临床评估急性、慢性心力衰竭患者的预后。目前，临床上使用的sST2试剂盒主要由美国4家公司生产，其中Critical Diagnostics公司（以下简称：CD公司）的Presage ST2试剂盒使用最广泛[9-10]。彭剑桥[11]对CD公司的Presage ST2试剂盒进行性能验证研究，发现sST2检测试剂盒批内精密度变异系数（coefficient of variation，CV）%分别为4.8%和2.8%，批间精密度CV%分别为5.9%和6.7%，线性范围为0.000～206.622 ng/ml，说明Presage ST2 检测试剂盒的性能符合临床检测的需求。戴谦等[12]使用CD公司的Presage ST2试剂盒测试上百例正常人血清中sST2 含量，分别确立了中国华东地区男性和女性的sST2参考区间（男性10.2～41.0 μg/L，女性8.9～28.1 μg/L），且该研究发现健康人群的sST2不受年龄、肾小球滤过率、体质量指数（body mass index，BMI）等指标的影响[13]。

1.2 荧光免疫层析法

荧光免疫层析法采用免疫荧光快速定量检测技术结合干化学层析方法，利用样本中的sST2抗原与试纸条上或缓冲液中荧光标记的sST2抗体结合形成抗原-抗体结合物，混合样本流经或加入试纸条时，该结合物被试纸条上的另一个sST2抗体捕捉，形成抗体-抗原-抗体夹心结合物[14]。因此，样本中的sST2抗原越多，试纸条上的抗体-抗原-抗体夹心结合物堆积得也越多。荧光信号的强度反馈被捕捉的sST2抗原数量，通过配套的免疫荧光分析仪的判断，能够定量检测出样本中sST2抗原的浓度。Dieplinger 等[15]对CD公司的ASPECT-PLUS ST2 Test 试剂盒进行性能验证研究并与MBL和PRESAGE ST2 ELISA进行了分析和临床分析比较，结果发现，在低浓度（20.8 ng/ml）时批内CV%为16.8%，总CV%为17.0%；中间浓度（65.6 ng/ml）时批内CV%为10.1%，总CV%为10.2 %；高浓度（131.8 ng/ml）时，批内CV%为9.6%，总CV%为10.0%；在23.6～229.6 ng/ml 范围内，线性良好，说明ASPECT-PLUSTM ST2 Test 试剂盒的精密度、线性范围均符合临床检测要求；此外，该研究还发现MBL ST2检测、PRESAGE ST2检测和ASPECT-PLUS ST2 Test 检测之间分别存在常数和比例偏差，但是，在建议的35 ng/ml 的临界值下，通过PRESAGE ST2检测和ASPECTPLUS ST2 Test 检测获得的sST2结果相似。在临床测试中，这3种检测被认为对诊断心力衰竭（AUC：MBL ST2检测为0.670，PRESAGE ST2检 测 为0.626，ASPECT-PLUS ST2 Test 检测为0.630）和预测呼吸困难患者的年死亡率（AUC：MBL 检测为0.743，PRESAGE ST2检测为0.742，ASPECTPLUS ST2 Test 检测为0.752）同样有用。

1.3 分子印迹聚合物结合纳米粒子多重传感器分析技术

分子印迹传感器技术因具有高的灵敏度、好的选择性、简单的操作、较低的价格，在食品检测、药品分析和环境监测等领域有着广泛的应用[16]。Crapnell 等[17]研究心脏脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid bindingprotein，H-FABP）和sST2的分子印迹聚合物结合纳米粒子（molecularly imprinted polymer nanoparticles，nanoMIPs）多重传感器分析技术，通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）分析表明，nanoMIPs 的亲和力与市售抗体相似。此外，这种传感器平台能够以最小的交叉，选择性地同时测量H-FABP 和sST2；通过对流通池内的热流分布进行建模，3个热电偶平行放置的形式具有最高的灵敏度。因此，该技术由于高选择性、测量时间短，并且该阵列格式的成本低，可替代传统的免疫测定。

1.4 双色上转换纳米粒子荧光免疫分析技术

上转换纳米粒子( upconversion nanoparticles，UCNPs) 是一种稀土离子混杂的无机纳米材料，具备稀土离子的独特能级结构和反斯托克斯发射的性质，与其他荧光材料相比，其发射峰窄、发光易于调控、光学稳定性好、寿命长、毒性低等特性，现已被科研人员争相进行广泛开发研究，使其在生物医学领域展现出较大的应用潜力[18-20]。目前，双色上转换纳米粒子（dual-colour UCNPs）已经在多组分物质分析检测中得到很好的应用[21]。

You 等[22]开发了一种高灵敏度和特异度的可定量的家庭预后平台（UC-LFS 平台），该平台集成了基于智能手机的阅读器和dual-colour UCNPs 荧光免疫分析技术，利用dualcolour UCNPs 可同时定量脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）与sST2，检测结果可以快速与临床医师共享。为确认UC-LFS 平台检测结果的准确度、可靠性，该平台检测了38个临床血清样本，成功检测到这些临床样本中sST2的最低浓度为29.92 ng/ml，BNP 的最低浓度为17.46 pg/ml，并与美国食品和药物管理局批准的临床方法检测结果进行比较，结果两者具有良好的线性相关性，表明UC-LFS 平台在临床上具有实际的可靠性和稳定性。

1.5 其他检测方法

经在国家药品监督管理局网站查询sST2的其他检测方法后发现，星童医疗技术（苏州）有限公司注册了循环增强荧光免疫法的sST2检测试剂盒，北京利德曼生化股份有限公司注册了磁微粒化学发光法的sST2测定试剂盒，天津欧尔克医药科技有限公司注册了时间分辨荧光免疫层析法的sST2检测试剂盒，北京热景生物技术有限公司注册了磁微粒化学发光免疫分析法的sST2测定试剂盒，广州春康生物科技有限公司注册了化学发光免疫分析法的sST2检测试剂盒。但以上方法未见相关的文献报道。

2 小结与展望

sST2是近年发现的重要的心力衰竭生物标志物之一，分别在2013年被美国心脏病协会/美国心脏学会（American College of Cardiology/American Heart Association，ACC/AHA）心力衰竭指南，2014年被中国心力衰竭诊断和治疗指南列入生物标记物的推荐之中，说明sST2在心力衰竭诊断、治疗和预后评估中具有明确的价值[23-24]。因此，实现高效、准确的sST2检测是本领域研究者孜孜不倦的追求。可以预期，随着免疫荧光技术和纳米粒子技术的快速发展，sST2检测技术将会在灵敏度、特异度、检测限、检测效率等方面实现突破。