喉返神经损伤基因治疗的研究进展

李浩，代文杰

(哈尔滨医科大学附属第一医院甲状腺外科，哈尔滨 150001)

喉返神经是第10对脑神经迷走神经的分支之一[1]，喉返神经损伤是甲状腺手术的严重并发症之一，单侧喉返神经损伤会造成声音嘶哑，双侧损伤会造成呼吸困难甚至窒息[2-3]。由于左侧喉返神经走行较长，喉返神经损伤发生率较右侧高1倍左右[4-6]。据统计，甲状腺术后暂时性和永久性喉返神经损伤的发生率≤11%,一旦损伤将给患者身体及心理造成巨大伤害[7]。通常喉返神经损伤由术中操作不当、颈部恶性肿瘤侵袭、气管插管等造成[4]，其中手术误伤是喉返神经受损的主要原因之一，损伤方式包括结扎、钳夹、离断、能量器械损伤等[8]。如果术中发生神经离断可以通过喉返神经重建术修复，但由于术后喉部运动功能的恢复效果不明显，这一处理方式很少被大众接受[9]。

基因治疗在周围神经损伤治疗中具有广阔的应用前景，它是一种通过单次给药在一定时间内转导基因并产生治疗蛋白的药物传递系统[10]。研究显示，可通过建立病毒载体将目的基因传递给运动神经元及周围神经元的施万细胞，从而实现神经功能的恢复。研究发现，一些神经营养因子和生长因子可能对中枢神经系统产生保护作用[11]。现就基因治疗在喉返神经领域的研究进展予以综述。

1 基因转导方法

喉返神经基因治疗的第一步是转导基因的确认，目前报道中用作载体的有腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector，AAV)、腺病毒载体(adeno viral vector，AdV)、肌肉特异性非病毒载体、质粒、仙台病毒；第二步是明确治疗对象，即保护中枢神经系统中的运动神经元，促进神经轴突再生，保护喉肌的运动终板，防止喉肌萎缩[11]。

1.1喉返神经和中枢神经系统 基因治疗的靶点包括喉返神经和中枢神经系统，携带治疗基因的病毒载体可通过注射进入喉返神经中再传递至中枢神经，目前基因治疗常用载体是AAV，该载体在目前所发现的载体中安全性最好。Rubin等[12]向喉返神经注射重组AAV扩散报告基因，并在大鼠脑干内成功检测到表达基因；此外原位杂交实验显示，大鼠脑干内存在病毒DNA[13]，说明病毒和转基因产物均可在中枢神经系统内逆突触运输。

有研究将腺病毒用于神经系统的基因治疗，但有部分学者认为腺病毒具有毒性会产生免疫反应而不推荐用作载体[14-15]。此外，Rubin等[16]研究发现，将AdV注射到喉返神经中不会造成明显的额外神经元损伤，注射后1周在大脑疑核检测到转入基因的表达；Araki等[17]在同一模型中验证了基因通过逆向转运在大脑中表达。

1.2喉肌和声带黏膜 喉肌和声带黏膜是基因治疗的另外两个靶点，将治疗基因导入喉肌，可产生肌营养和神经营养作用，防止喉返神经损伤后肌肉萎缩，并可以保护运动终板。有研究利用高水平的肌肉特异性基因表达载体将报告基因(LacZ)和治疗基因[胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)]导入大鼠的瘫痪喉肌，经逆转录聚合酶链反应检测发现，治疗组81.3%(13/16)的大鼠在注射4周后检测到治疗基因编码的mRNA，说明治疗基因通过喉肌运输成功，单次、延迟注射运载体可能产生更好的神经恢复效果[18]。此外，电穿孔基因即质粒传递，也可作为一种新的喉肌基因转导方法，并且该方法具有转染率高、组织损伤小的优点[19]。

仙台病毒是副黏病毒家族的一员，是一种具有非片段、负义RNA基因组的包膜病毒，仙台病毒载体具有对人无致病性、能有效地感染气道上皮细胞的特点[20]，仙台病毒载体可以携带至少5 000个碱基量的基因，并且仅需小于5 min的载体细胞接触时间就能将基因导入细胞。Mizokami等[21]研究了仙台病毒载体对喉肌和气管上皮的转导作用，发现在正常气管上皮中，喷雾吸入法优于注射法，前者报告基因的表达更加显著且持久，吸入法的发现为基因转导提供了一条新的途径。

2 喉返神经损伤的基因治疗

喉返神经的基因治疗与神经营养因子和生长因子密切相关，其中包括神经生长因子、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)、成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子、血管内皮生长因子以及IGF-1[22]，它们具有促进周围神经纤维再生的作用，其中前3种因子在神经修补中显示出较强的促进轴突增长作用[23]。

2.1喉肌萎缩的预防 喉返神经损伤后，喉肌失去神经支配，容易发生萎缩，因此神经修复前预防喉肌萎缩尤为重要。Shiotani等[24]建立了大鼠喉麻痹模型，将含有IGF-1基因的肌肉特异性非病毒载体注入成年大鼠的瘫痪喉肌，单次注射28 d后，与对照组大鼠(相同部位注入等量0.9%氯化钠注射液)比较，转染IGF-1的大鼠肌纤维直径、运动终板长度和神经相关终板的百分比显著增加，Gugatschka等[25]的研究也得出相同的结论；另有研究对IGF-1基因转移后的肌球蛋白重链组成进行分析发现，失神经支配喉肌的ⅡA/X型肌球蛋白重链受到抑制，而ⅡL型肌球蛋白重链表达升高，从而使喉肌的肌球蛋白重链组成正常化[26]。对比单次和多次注射后效果发现，多次注射动物IGF-1的mRNA基因表达率高于单次注射(100%比81%)，但两者生物反应比较差异无统计学意义[17]。IGF通过修复喉肌肌球蛋白重链组成预防喉肌萎缩。

在临床中喉返神经损伤的治疗并不一定在发生后即刻进行，由于喉返神经存在自主恢复的可能，一般需要观察等待几周至几个月，而上述实验中的动物均是在喉返神经受到损伤后立即接受治疗，为了观察两者间的差别，有研究对损伤后立即治疗的大鼠和延迟30 d治疗的大鼠进行比较，发现单次延迟的IGF-1肌内注射可以更好地促进肌肉再神经支配[18]。

2.2中枢神经系统运动神经元丢失的预防 喉麻痹治疗中的一个主要问题是疑核运动神经元的丢失，疑核运动神经是控制喉返神经运动的中枢，运动神经元丧失将造成不可逆性损伤。为了评估基因治疗对迷走神经及喉返神经损伤后运动神经元损伤逆转的潜力，Hernandez-Morato 等[27]验证了编码GDNF的AdV对疑核神经元损伤成年大鼠的保护作用，通过迷走神经撕脱模型模拟疑核运动神经元萎缩和丢失，发现接种治疗载体可防止疑核内受损运动神经元的丢失，改善乙酰胆碱转移酶的免疫反应，阻止受损神经中的一氧化氮合酶发挥作用。Moro等[28]在同一动物模型中证实了腺病毒转运BDNF和(或)GDNF对神经的作用，与对照组(人为破坏神经后不进行基因治疗)相比，BDNF或GDNF治疗后能显著预防运动神经元的丢失，BDNF的保护作用大于GDNF，并且BDNF与GDNF联合治疗具有协同作用，与BDNF或GDNF单独治疗相比，疑核内的运动神经元数量明显增多，受损神经内的一氧化氮合酶也受到抑制，表明腺病毒介导的BDNF和(或)GDNF基因转移可预防迷走神经损伤或喉返神经损伤后运动神经元的变性。由此表明，喉返神经的损伤修复与神经营养因子密切相关，通过促进神经营养因子基因的表达，使受损神经的功能得以恢复。

2.3神经纤维再生与神经功能恢复 喉返神经损伤后的另一个主要并发症是神经纤维变性和再生不良,目前关于喉返神经基因治疗后神经功能和组织学恢复的报道较少。Sakowski等[29]研究发现，通过腺病毒将GDNF基因直接导入大鼠受钳夹损伤的喉返神经后，受损神经的功能和组织学结构得到恢复，并且受损喉返神经的运动神经传导速度明显提高，GDNF治疗4周后大鼠的运动神经传导速度基本恢复正常，与对照组(注射0.9%氯化钠注射液)相比，治疗后的神经轴突直径更大，受损处的神经修复能力更强。说明GDNF基因转入对喉返神经损伤后组织修复再生和神经功能恢复具有明显的促进作用。此外，如果术中损伤迷走神经或喉返神经，直接将载体注射到神经中还可以起到预防神经瘫痪的作用。

另一项研究发现，喉返神经受损后注射编码锌指蛋白的AdV(Ad-p65)，可以诱导血管内皮生长因子表达,从而加速受损神经轴突的生长，恢复声带活动性，并保留甲杓肌神经的终板功能[30]，多种神经生长因子被证实可促进神经纤维再生。

2.4喉功能的恢复 喉返神经基因治疗的最终目的是恢复患者的喉部功能，使声带运动恢复正常，并与呼吸、吞咽和发声同步。Araki等[17]首次发现利用基因治疗可以恢复大鼠声带运动功能，他们直接将编码GDNF的AdV注射到喉返神经的受损部位，注射后2周发现声带运动功能明显恢复。Sakowski等[29]建立了喉返神经损伤模型，研究可以诱导血管内皮生长因子表达的Ad-p65 AdV的效用，注射后7 d与对照组(损伤喉返神经后不做任何处理)比较发现，治疗组大鼠声带的运动幅度显著增强，说明基因治疗可以加速大鼠喉部声带功能的恢复。Rubin等[30]尝试运用携带锌指蛋白基因的AAV刺激内源性IGF-1生成，注射7 d后发现实验组(在受损神经处注射携带锌指蛋白的AAV载体)视觉模拟评分高于对照组(在受损神经处注射携带绿色荧光蛋白的AAV载体)，证实大鼠喉部功能恢复。

3 基因治疗喉返神经损伤的未来研究方向

尽管基因治疗已被证明对中度喉返神经损伤有效，但喉返神经损伤治疗中还有一个最重要的环节有待解决，即神经元错误定向再生。由于新生的神经纤维无法有效辨别之前的高级别神经元，会出现新生神经纤维之间错误连接的情况，虽然部分肌肉功能得到恢复，但同时也会产生一些神经错误支配肌肉活动的情况，这为喉部功能的精准恢复造成了困扰。喉返神经钳夹损伤模型中声带的损伤程度较轻，保留了神经的完整性，与神经离断模型相比，受神经纤维错向再生的影响更小[31]。

要实现严重喉返神经损伤后声带运动功能的恢复，需要解决神经纤维错向再生的问题。此外，由于声带唯一外展肌是环杓后肌，阻止环杓后肌轴突再生可增强声带的内收功能，恢复声带运动[32-33]。研究显示，神经营养因子抗体在喉肌中的表达存在差异，可作为促进喉返神经再支配的治疗靶点，Hernandez-Morato等[18]报道了抗GDNF抗体对喉返神经再神经支配的影响,抗GDNF抗体注入环杓后肌可以影响再神经支配模式，并减少联合运动，增加功能神经的支配。同样，除神经营养因子抗体外，抗癌药物长春新碱也可以阻止环杓后肌的神经再支配，从而改善喉收肌功能[34]。

声带功能恢复的另一个策略是减少运动神经与其他神经纤维之间的错误定向神经再支配，喉返神经除感觉和自主神经纤维外，还包括运动纤维，运动神经纤维与感觉神经纤维或自主神经纤维之间的错向连接是导致功能恢复失败的主要原因之一。有研究报道，使用一种新型的聚乙醇酸胶原管作为喉返神经再生中药物或载体给药支架，可将一种抑制感觉轴突扩张的药物插入该管，然后桥接到喉返神经，从而促进声带恢复[35]。

4 问题与展望

在动物喉返神经损伤模型中，基因治疗在预防喉肌萎缩和运动神经元丢失、保留神经终板、再生神经纤维、促进神经功能恢复等方面具有重要作用。尽管在这些领域的研究有限，但现有的研究成果值得参考，未来的临床应用前景值得期待。但目前仍存在一些有待解决的问题，如每项研究均采用了不同的动物模型、不同的基因转导方法和不同的治疗方式，这使得各项研究结果难以进行横向比较，因此有必要进行相同试验条件下的研究，从多种方法和治疗方案中找出最佳切实可行的一项：明确最佳的导入基因、建立最优质的载体、选择最高效的植入方式，从而促进该治疗方式的推广。

尽管一些报道提到并未发现基因治疗造成的组织学损伤和免疫反应，但并不是没有任何不良反应，相关方面的调研还有待完善以及更深入的研究。目前研究已经证明了将AAV或AdV传递到中枢神经系统的有效性，但同时也显示出一定的局限性[13-14]，如中枢神经系统的重点区域疑核将受到扩散传递的潜在不良影响。腺病毒基因表达的有限时效性可能符合喉返神经损伤的特征，其暂时性的基因表达特点更适合于这种短期治疗，但是短期转基因表达的机制之一被认为是由转基因细胞的免疫反应产生的，而AdV具有毒性和免疫原性，这也正是部分学者摒弃AdV的原因，他们不提倡使用这种载体进行转运，因此有必要研发更加高效、毒副作用更小的载体，为基因治疗在安全性方面提供有力的保障。