发酵法在中药研究中的应用

李艳凤，翟梦颖，李雨昕，王蔚佳，刘征

(1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150040)

发酵法是中药炮制的传统方法，其具有节约药料、减毒增效的作用。虽然中药经发酵炮制，改变了以往的煎煮、蒸浸、炼制等常用工序，但药物疗效明显增强。如中药淡豆豉，是由桑叶或麻黄等发酵后制得，而采取不同的培养基，经过相同的微生物处理之后，药物的药性会发生明显变化，所以利用这一特性，可制得不同适应证的中药[1]。发酵炮制中药的方法早在我国汉代最早的中药学著作——《神农本草经》中就有记载，之后的史料，如《本草纲目》《本草蒙筌》《药性论》及《韩氏医通》中也能找到相关依据。现代中药发酵技术是在传统发酵技术上进一步创新发展，将中药发酵与生物工程学、微生态学等现代生物技术结合，对药材进行处理，前景广泛。为进一步发掘发酵法在中医药事业中的新用途、新发展，现就发酵的历史沿革、发酵方式、目前通过发酵炮制的主要中药品种、发酵炮制对药材的作用及应用前景等予以综述，旨在阐述发酵应与现代技术相结合，从而建立以药效学为最终评价标准的质量评价体系，为中药发酵炮制的研究提供参考和新思路，同时传承、发展、创新中医药事业，丰富世界医学事业。

1 发酵的历史沿革及现状

在微生物学中，发酵是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物，同时释放能量并产生各种不同的代谢产物[2]。但在工业、食品及其他产业生产中，“发酵”是一切以微生物为依托进行各类生产的统称。根据史料记载及推测，早在8 000年以前，我国就已经出现了曲蘗酿酒；4 000多年前，酿酒已变得十分普遍；2 500年前，勤劳的古代人民发明了酿酱、醋，并用曲这一特殊的中药剂型治疗消化道疾病。先秦时期，《庄子·知北游》中记载发酵为“其所美者为神奇，其所恶者为臭腐。臭腐复化为神奇，神奇复化为臭腐”[3]。可见，那时人们已认识到在发酵的过程中发生了物质转化。东汉时期，“医圣”张仲景所著《伤寒论》中载有“栀子豉汤方”“栀子甘草豉汤”“栀子生姜豉汤”等含有豆豉的方剂，可知豆豉在方剂配伍中具有一定的效用；北魏时期，农学家贾思勰所著《齐民要术》里详细记载了制曲、酿酒、制酱和酿醋等工艺；到了宋代，发酵广泛用于中药炮制，出现了“半夏合生姜制曲法”，《太平惠民和剂局方》针对其中记载的相关方剂，描述了具体的操作方法。此外，医之始祖——《黄帝内经》对发酵也有些许记载，其中就有将药酒称为“醪醴”的说法。

在中药炮制中，中药发酵法是指经净制或处理后的药物，在一定的温度和湿度条件下，由于真菌和酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法[4]。炮制前后药材性能、治疗作用均大为改变。但是因发酵过程中会产生微生物，且其种类众多、数量巨大，目前的检测方法难以辨清，故2015版《中国药典》收载的经发酵方法炮制的中药材仅有淡豆豉一种。

2 发酵方式

随着各类技术的蓬勃发展，中药发酵法与微生态学及现代生物工程的结合，形成了中药发酵制药技术。与传统中药发酵相比，在微生物生长代谢过程中发生了益生菌的转化，出现一些突破性的变化，如在加工过程中，大分子材料经逆转录形成小分子，从而使有效成分进入人体后吸收完全，药效充分发挥；在新技术中，多层次、多菌种共同发酵，药材疗效提高；微生物发酵状态下，中药中某些有毒物质被分解，毒副作用明显降低；在性味方面，由于发酵过程能够改变或遮蔽药材原有苦味，从而更易为人们所接受，所以利用发酵法处理中药日益受到学者重视[5]。将现代生物技术应用于中药发酵，成为中药研究的重要方法，Lv等[6]通过巢式聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳研究与红曲糯米酒发酵起始物(红曲和姚曲)相关真菌和细菌的微生物组成发现，真菌与细菌对红曲糯米酒的发酵过程具有重大作用，并在一定程度上指导了大规模生产。

2.1固体发酵 固体发酵是指在没有自由水或自由水含量极低的条件下，以一定湿度农副产品为营养基质，以一种或多种真菌为菌种发酵，该发酵方法是从制曲工艺发展而来，后经改进优化形成。如半夏曲、六神曲、沉香曲等，其发酵过程操作简单，温度、湿度、酸碱度、氧含量等环境条件易于控制，不易感染杂菌，因此药效能得到充分的发挥。迟晓丽等[7]研究发现，中药固体发酵的关键在于优势菌种的选育，产率高、转化率高、毒性低的菌种是理想选择标准。刘学湘等[8]利用白僵菌固体发酵处理马钱子，采用急性毒性实验法和醋酸引起小鼠扭体法、热板法等实验方法，探究马钱子的急性毒性及阵痛活性，结果证实发酵后药材的毒性作用减弱而镇痛活性明显增强。

2.2液体发酵 液体发酵是一种现代发酵技术，依托抗生素生产工艺，将生长情况良好的菌丝接种到含有一定比例中药材培养基中，然后将培养基置于适宜环境条件下进行发酵。该种发酵方法相较固体发酵法有所突破，因而应用更为广泛。但由于大多数中药容易在发酵过程中被污染，所以其对工艺设备的要求较为严格。杨瑾等[9]以高胰岛素抵抗人肝癌HepG2细胞作为受试对象，探究不同浓度茯苓胞外多糖对葡萄糖的抑制程度发现，经液体发酵后的茯苓胞外多糖降低血糖作用明显优于其他浓度或未经发酵处理的胞外多糖。此外，液态深层发酵还广泛用于红曲的生产菌种研究与大规模生产[10]。

2.3双向性固体发酵 双向性固体发酵于20世纪80年代由南京中医药大学庄毅教授首次使用，此技术依托固体发酵，与其不同的是将菌种生长的营养基质变为中药材或药渣，使得中药材在为真菌提供营养物质的同时，自身的结构成分也被真菌的代谢产物或细胞因子影响，从而使药材出现与原来不一样的功能性味，由此具有双向性[11]。朱舟等[12]采用固体发酵方式，以中药天南星为底物，在适宜的白僵菌接种量、温度和时间下，以含水量适宜的天南星粗粉-鲜豆渣-米粉作为培养基，发现在一定参数下得到的天南星炮制品与其他方法相比，毒性降低但抗惊厥作用升高。因此，白僵菌在固体发酵技术下对天南星具有减毒增效的作用。

3 发酵炮制的主要中药品种

据《本草纲目》《本草蒙筌》《药性论》及《韩氏医通》等史料记载，采取发酵炮制制成的中药主要分为两大类：①中药自身经过一定条件发酵，如淡豆豉、百药煎等。②药物通过与一定介质混合产生微生物进行发酵，如六神曲、半夏曲、沉香曲等。现分别介绍如下。

淡豆豉，收载于《本草汇言》，由青蒿、大豆、桑叶三者自然发酵得到。味苦、辛，性凉；归肺、胃经；具有解表、除烦、宣发郁热的功效，主要用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠[13]。郭文勇[14]研究发现，淡豆豉中的主要生物活性成分为大豆异黄酮，该成分在预防及抵抗癌细胞方面具有一定作用。在中药发酵炮制的基础上，有学者采用单菌种和双菌种发酵淡豆豉，以不同发酵阶段产物的纤溶酶活性为测定指标探究最佳条件，结果发现以单一的枯草芽孢杆菌进行发酵的产物优于其他菌种，这为淡豆豉的大规模制备提供一定的理论支持[15-16]。

百药煎，出自《本草蒙筌》，是由五倍子与茶叶发酵而成的灰褐色块状物。《本草纲目》载：“其体轻虚，其性浮收，且味带余甘，治上焦心肺，咳嗽痰饮，热渴诸病，含噙尤为相宜”[17]。有学者发现，五倍子的有效成分鞣质在体内易与蛋白质发生沉淀反应，患者使用后会产生不良反应，而经发酵制成百药煎后，其有效成分刺激性减小、收敛性增强，且能在一定程度上减少甚至使不良反应消失。

六神曲，又称神曲，载自《齐民要术》。现在常用的工艺是将切碎的鲜辣蓼、鲜苍耳子、鲜青蒿与研末后的赤小豆、杏仁与麦麸和白面和匀，经自然发酵制成的曲剂，具有健脾和胃、消食和中的功效。传统神曲发酵为自然发酵，即杂菌发酵的方式，可控性较差，发酵产物质量优劣不一。程亦雄[18]通过水解圈法筛选优势菌种，得到产蛋白酶及淀粉酶活性较高的赛氏曲霉，以正交试验的方法优化六神曲深层发酵工艺。

半夏曲，出自《太平惠民和剂局方》，是将半夏洗后、姜汁碾捣作曲自然发酵而成。其主治风寒咳嗽、喘息气急，消食积，治泄泻。因半夏中含有的草酸钙针晶具有刺激性，故临床常应用其炮制品，但对半夏发酵制曲后的毒性变化研究较少。孙佳彬等[19]通过一系列实验得出经发酵制成曲后的半夏毒性减弱的结论，为半夏经发酵制成半夏曲可在一定程度上降低药材毒性提供了理论基础。

沉香曲，收于《饮片新参》。沉香曲是由沉香、木香、檀香、砂仁、蔻仁、神曲等20多种药材研成粉再加面粉，搅和压制而成。其功能为理脾胃气，止痛泻，消胀满。主治肝胃不和，胸闷脘胀，呕吐吞酸[20]。在临床应用方面，沉香曲重气滞诸症，与多用于湿痰的半夏曲，主健脾胃、助消化的神曲有所不同[21]。

4 发酵在中药炮制中的作用

4.1增强药物疗效 中药发酵炮制通过微生物与中药共同发酵，在此过程中微生物经发酵产生的次级代谢产物和药物成分相互协同、增强药效，其原因为次级代谢产物与药物发生作用的同时拓宽了代谢途径，甚至会产生明显不同的有效成分[22-23]。王贞佐等[24]将焦三仙、黄芪、当归、海马、柴胡制成的提取液作为培养基，探究该中药提取液对冬虫夏草的生长及其菌丝体中有效成分含量影响的研究显示，中药提取液对冬虫夏草菌丝体的生长刺激作用明显，且冬虫夏草中甘露醇成分的含量显著提高，此外提取液中含有的多糖也发生量的变化。胡昌江等[25]分别以小鼠、大鼠作为实验对象，通过对小鼠的氨水引咳、酚红祛痰、二甲苯耳郭肿胀实验和大鼠的皮下塑料环肉芽肿增生等实验，并结合体外抗菌实验比较改良百药煎在发酵前后的镇咳、祛痰及抗炎作用证明，与发酵前相比，发酵后的改良百药煎镇咳、祛痰、抗炎及抗菌作用明显增强。李世杰等[26]利用黑曲发酵茯苓多糖进行研究显示，经发酵的茯苓多糖各剂量组的小鼠脏器指数、溶血素水平、抗体IgG与IgM含量、单核-巨噬细胞吞噬率均显著提高且能明显增强环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用。

4.2提高有效成分提取率 中草药的有效成分大多包裹在其细胞壁内，致密坚硬的细胞壁是阻碍药物有效成分从细胞内溶出、妨碍体内吸收的屏障。因此，微生物对有效成分的提取发挥了一定作用。它能针对不同成分构成的壁结构，分泌各种胞外酶，使构成紧密的结构分解，使细胞与细胞间的空隙变大，不仅为细胞内外的物质扩散提供通道，还能提高有效成分的提取率、吸收利用率。贾艳姝[27]以保加利亚乳杆菌为生产菌种发酵黄芪发现，发酵前后黄芪总皂苷和总黄酮均有不同程度的增加。冯志华等[28]使用地衣芽孢杆菌C2-13(可产生水解酶)发酵处理红花发现，其可在一定程度上增强产物羟基自由基清除能力、对肝氧化物的抑制能力，提高红细胞溶血抑制率等。徐萌萌等[29]研究发现，微生物与苷分子间存在一种独特的作用，糖类可在微生物的参与下代谢，牛蒡子、甘草、栀子、黄芩的苷转化为苷元，即通过分解不易被人体吸收利用的成分，使有效成分充分释放并发挥作用，缩短作用时间的同时提高药材效用。在治疗急性耳郭炎方面，牛蒡子、甘草等发酵处理品的药效较生品显著增强[29]。

4.3降低药物毒性 中药不是完全无害的，有些药物因其自身所含化学成分的种类多样，具有一定程度的毒性和刺激性，所以人们在使用时会出现一些副作用。有些药材经发酵处理后，其毒性或刺激性明显减弱，这是由于在微生物的作用下，毒性成分的结构发生改变，变成低毒甚至无毒的物质。吴晓峰[30]通过小鼠口服急性毒性实验、小鼠耳壳肿胀实验、兔红细胞溶血实验发现，发酵后的巴豆不仅毒性降低且效用增强，其中灵芝和白僵菌发酵得到的灵巴菌质和白巴菌质部分减毒作用明显优于传统的发酵产物巴豆霜。朱舟等[12]将白僵菌与天南星采用双向发酵技术进行处理得到毒性较小、抗惊厥力较高的产物，达到减毒增效的目的。另有研究发现，经发酵处理后的大黄，其泻下作用的有效成分结合型蒽醌的含量明显下降[31]。

4.4改变活性成分 发酵对药材活性成分的影响体现在新成分的产生及原有成分的转化。发酵过程表现为在酶的作用下，微生物代谢过程中的大分子成分被分解、转化，进而在一定条件下合成新化合物，产生效用更强的有效成分。董玫等[32]通过实验发现，将滋阴补肾经典方剂六味地黄丸进行发酵，所得到的发酵液能抑制小鼠肝癌H22生长，而将其进行煎煮后得到的液体不具有该作用。李国红等[33]将三七的须根粉碎，接种枯草芽孢杆菌进行固体发酵，并使用相应的仪器技术对发酵所得物中的皂苷成分进行分离，结果发现在三七及其原料药中均没有发现新成分——人参皂苷Rh4，证明在发酵的过程中活性成分发生变化。

此外，在人体内不可直接被利用的有效成分，可在体外通过发酵进行转化，转化后的有效成分可直接被机体利用。

5 小 结

中药是我国的宝贵财富，但随着工业化的日益发展及不合理的开发利用，药用植物资源逐渐匮乏，野生中药材濒危，因此提高药用资源利用率是开发利用中药的有效途径之一。而作为中药炮制领域研究热点之一的发酵法，具有改变药物性质、提高疗效、减少毒副作用等优点，为我国丰富药用资源的进一步研究、开发，乃至中医药事业的发展拓宽了研究范围。但由于中药成分复杂，作用机制阐释受限，且不同药物配伍后对有效成分产生微妙影响。同时传统方法发酵过程中易引入有害菌群，结果可控性不强，易出现安全事故。未来，应将现代发酵技术应用于中药制剂的研究开发，以推进中药现代化。