慢性肾脏病血管钙化机制及防治

黄双宜

汕头大学医学院第二附属医院肾内科,广东省汕头市 515041

血管钙化是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤、CKD和衰老等病症中普遍存在的病理表现，是心脑血管疾病高发病率和高死亡率的重要因素之一。在CKD患者中，冠状动脉钙化及全身其他血管钙化较普通人群更常见、更突出。CKD患者中血管钙化的发生、发展更多的与其特有的危险因素参与相关，包括透析龄、高磷血症、高钙血症、含钙制剂的不适当使用、维生素D制剂不适当使用、继发甲状旁腺功能亢进、炎症反应、氧化应激及尿毒症毒素等，其中钙磷代谢紊乱是关键因素。

1 CKD患者血管钙化特点

在CKD患者群体中，既往认为血管钙化主要发生在终末期肾病(End stage renal disease, ESRD)和透析患者中，但新近研究的动物模型显示，CKD早期可发生血管钙化，而且血管钙化出现时间可能早于CKD第2期[1]。

血管钙化可发生在血管壁的两个区域，即血管内膜和中膜。研究发现CKD患者动脉中膜和内膜钙化加速，这种钙化在透析患者中发展迅速[2]。内膜钙化与血脂异常有关，并与炎症和内膜层增厚一起引起动脉粥样硬化。这一过程在血管内壁上形成斑块，斑块不稳定，容易破裂。内膜钙化容易导致血栓形成和闭塞性疾病。中膜由平滑肌细胞组成，由疏松的结缔组织(主要是弹性蛋白)构成，中膜钙化常继发于糖尿病或CKD，这也可以称为Monckeberg动脉硬化，特别是在没有任何管腔狭窄的中膜钙化的情况下。中膜钙化导致血管僵硬、收缩性高血压和左室肥厚。虽然CKD患者可以发展成两种类型的血管钙化，但中膜钙化是CKD患者的特征性血管变化，且是在慢性肾病儿童患者中观察到的血管钙化的唯一形式[3]。

2 CKD患者血管钙化机制

CKD患者钙化的发展与长期高磷酸盐血症及短暂性高钙血症这种矿物代谢紊乱密切相关。重要的是，细胞外高水平的钙磷矿化物质已被证明是介导血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)转分化成骨/软骨细胞表型的关键因素，促进VSMCs出现凋亡并产生基质小泡，表达骨相关蛋白，导致促进和抑制钙化因子失衡，从而启动以羟磷灰石聚集(晶核形成)和增长为特征的矿化过程，最终导致血管钙化。

2.1 钙和高磷酸盐诱导钙化细胞机制 临床和流行病学研究一致表明循环中高水平的钙离子和磷酸盐对VSMCs有明显的影响，他们的协同作用，特别是通过形成羟基磷灰石纳米晶体，这会加速钙化[4]。关键过程包括VSMCs骨软骨细胞分化、凋亡、囊泡释放和钙化抑制剂水平的紊乱。VSMCs在高钙、高磷酸盐情况下发生类软骨细胞分化。这些分化的类软骨细胞下调平滑肌特异基因的产生，如平滑肌(SM)，α-肌动蛋白和SM22。同时，并上调骨软骨生成的标志物，包括Runx2(cbfa1)、成骨相关转录因子(osterix)、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、骨钙素和碱性磷酸酶(ALP)。这些成骨细胞/软骨细胞样细胞失去其收缩特性，但能够产生胶原基质，形成钙、磷丰富的基质囊泡，能够启动血管壁的矿化。VSMCs的表型改变似乎是病理钙化途径中的一个重要步骤[5]。磷诱导的血管钙化被认为是一种适应性的VSMCs从收缩型向成骨/软骨型转变。Runx2是一种转录因子，在成骨细胞和软骨细胞分化中起重要作用，它诱导主要骨基质成分(包括Ⅰ型胶原、骨钙素和OPN)的表达。VSMCs中Runx2的敲除可抑制成骨转化和基质矿化。ALP是正常骨形成所必需的，被认为通过灭活矿化抑制剂焦磷酸盐和磷酸化骨桥蛋白(P-OPN)来调节血管基质矿化，同时释放游离磷[6]。

血清磷酸盐升高促进血管基质钙化的另一机制是通过刺激血管平滑肌细胞凋亡。生长停滞特异基因6(Growth arrest-specific gene 6)的表达下调可能是一个重要的潜在机制。在磷诱导的人主动脉VSMCs钙化过程中，生长抑制特异基因6及其受体Axl的表达均降低[7]。生长抑制特异基因6抗凋亡作用通过Bcl2介导的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途径实现；磷酸化使Bcl2失活并激活促凋亡蛋白Bcl2相关的死亡启动子，导致caspase-3活化和凋亡。

高钙血症增加血管钙化的风险，体外证据也强烈支持钙促进血管平滑肌细胞钙化[8]。两项关键研究证明了当把钙单独加入人血管平滑肌细胞培养基时，促进矿化。而且，当钙和磷加入培养基后，它们在协同诱导矿化[8]。利用离体血管环的进一步研究表明，对于给定的钙磷产物，钙升高比磷升高更能诱导血管平滑肌细胞钙化[6]。钙在诱导细胞凋亡和羟基磷灰石基质囊泡的形成和释放中起着关键作用，而羟基磷灰石基质囊泡又形成矿物成核位点，促进进一步钙化[9]。正如高钙水平促进骨基质囊泡钙化一样，细胞溶质高钙水平可以改变血管平滑肌细胞衍生基质囊泡的内在特性并诱导其钙化。高钙水平导致膜联蛋白6-磷脂酰丝氨酸形成核复合物，增强基质金属蛋白酶-2活性，从而导致弹性蛋白降解和钙化。更重要的是，VSMCs暴露在高钙水平下最终会耗尽内源性基质囊泡中的钙化抑制因子γ-羧基谷氨酸基质蛋白MGP；当胎球蛋白A(Fetuin-A，FA)水平也降低时，如透析患者一样，囊泡中含有预成型的结晶羟基磷灰石，或具有矿化能力，从而促进进一步钙化[10]。

2.2 成纤维细胞生长因子23(Fibroblast growth factor 23，FGF23)/α-Klotho 最近在慢性肾脏病矿物质和骨异常(Chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)领域发现的两个与磷酸盐稳态相关的新参与者，即成纤维细胞生长因子(FGF23)和α-Klotho[11]。FGF23主要由骨中骨细胞产生的磷脂激素，FGF23的合成和分泌调节尚未阐明。但FGF23的水平可受到磷、钙、VitD衍生物、甲状旁腺素(PTH)和其他因素的影响。FGF23与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)1c、3c和4结合，在直接调节血清磷酸盐(Pi)水平中起主要作用。在肾脏近端小管中，它通过下调钠依赖性Pi协同转运蛋白，Pi Ⅱa和ⅡC，从而增加肾脏Pi排泄[12]。另外，FGF23抑制1羟化酶并增加24羟化酶活性，从而降低1,25-二羟基VitD(骨化三醇)生成，也有利于血清Pi维持正常水平。此外，FGF23对甲状旁腺中的甲状旁腺激素合成负性调节[13]。综合来看，FGF23的功能在于维持正常的血清Pi水平。

FGF23与FGFRs结合需要Ⅰ型跨膜蛋白α-Klotho作为一种必需的共受体。由于FGFRs的广泛表达，细胞上的α-Klotho被认为赋予了FGF23作用的组织特异性。由于α-Klotho 主要在肾脏、甲状旁腺和脉络丛中表达，既往认为FGF23的功能仅限于这些器官，越来越多的证据表明FGF23可能具有其他受体和靶组织，包括心脏[14]。在CKD中FGF23水平升高与肾功能不全和矿物代谢异常有关。然而，FGF23对血管钙化的潜在影响是有争议的。

α-Klotho基因和蛋白质最早于1997年被发现，随后被证明可以调节小鼠的寿命[15]。α-Klotho缺乏小鼠表现出高循环Pi和高骨化三醇的水平和动脉中层钙化的发展，几乎与在FGF23基因敲除小鼠中观察到的结果一致[16]。这些结果证实了FGF23和α-Klotho都协调了矿物稳态。事实上，α-klotho水平在CKD的人和动物模型中出现下降，被认为加速CKD-MBD的进展[17]。已鉴定出两种形式的α-klotho：膜结合α-klotho和可溶性α-klotho。可溶的α-klotho是由膜结合的α-klotho的胞外区脱落到循环中而产生的，它像激素分泌一样可以在远程的部点起作用。迄今为止的所有实验都表明α-klotho对血管钙化有保护作用。Hu等人报道了CKD小鼠病理模型α-klotho缺乏引起血管钙化，可溶性α-klotho可抑制Pi的钠依赖性摄取和Pi诱导的大鼠血管平滑肌钙化[18]。这些结果提示α-klotho的可溶性和膜结合形式是CKD中治疗血管钙化的潜在靶点。

2.3 维生素D在血管钙化中的作用 VitD受体激活剂(Vitamin D receptor activators，VDRAs)是治疗CKD继发性甲状旁腺功能亢进的常用药物，但其对血管系统的影响仍有相关争议。VSMCs表达VitD受体，并具有功能性的1-α-羟化酶和25-羟化酶系统，因此VitD代谢物可以自分泌/旁分泌的方式被VSMCs利用。VDRAs促进钙化通过上调Runx2(cbfa1)、成骨相关转录因子(osterix)、和骨钙素[19]，并增加钙转运入血管平滑肌细胞中。然而，其他研究表明，维生素D通过增加钙化抑制蛋白如基质γ-羧基谷氨酸基蛋白(Matrix Gla protein，MGP)和骨桥蛋白，减少促炎症细胞因子，如IL-6、IL-1β和TGF-β[20]，对防止钙化具有保护作用。重要的是，FGF23可以下调肾脏1-羟化酶受体表达，从而减少VitD的产生[21]，表明复合物FGF23-klotho与VitD在血管系统钙化中有复杂相互作用。临床和体外研究表明，VitD水平与血管测量可能存在双峰关联，因此低水平和高水平的VitD都与异常血管效应相关，还需要进一步研究以确定血管健康的最佳VDRAs及其最佳剂量[22]。故临床需严格控制VitD用量和钙摄入量，监测尿钙水平以防钙的异位沉着。

2.4 GRP(Gla-rich protein)、钙蛋白颗粒(Calciprotein particles，CPPs)与细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)的关系及在CKD中血管钙化作用 FA是目前发现的最强有力的血管钙化抑制物，它能直接与羟磷灰石晶体结合，防止羟磷灰石结晶增长，也可与钙磷结合防止钙磷沉积，有效的抑制异位钙化的作用。FA是肝细胞合成的急性负时相反应蛋白，CKD患者体内的炎症状态导致FA下降，加重血管钙化。MGP是由软骨细胞和VSMCs产生的血管钙化抑制因子。MGP抑制血管钙化的机制与FA相似。

在循环中发现一种FA-矿物复合物，也被称为CPPs，主要由钙和磷矿物、FA和钙调节蛋白组成，可能是防止异位矿化的重要机制。这种可溶性CPPs所含有的FA和其他蛋白可被视为具有稳定、运输和循环血液中水不溶性矿物作用的矿物伴侣[23]。

EVs是一种由多种细胞分泌的，内含核酸、蛋白质等的脂质双分子层。大多数细胞释放的EVs最终可以到达血液循环系统，除了在生理或病理钙化的开始中所起的重要的作用外(主要通过外泌体、微囊泡、凋亡小体、迁移小体等机制)，EVs被认为是细胞间通讯的主导者，因为它能够将其内部介质转移到受体细胞，从而影响和改变其正常功能。

从健康人群和CKD患者中分离出生物CPPs和EVs，并用超微结构、分析、分子和免疫技术进行比较。结果表明，GRP是循环中CPPs和Evs的组成部分[24]。CKD 5期患者血清CPPs和EVs的特征是FA和GRP水平较低[24]。CKD 5期中CPPs的矿物质成熟度增加，类似于次级CPP颗粒。血管平滑肌细胞钙化试验表明，CKD 5期中的CPPs、EVs被血管平滑肌细胞吸收，通过促进细胞骨软骨分化和炎症反应诱导血管钙化[24]。将CKD5期的CPPs与γ-羧基化的GRP孵育后，血管钙化效应得以缓解。Holt等人发现在体外，γ-羧基化GRP、FA和MGP的存在大大降低了碱性磷酸钙晶体的形成和成熟，并在体内鉴定出类似的抗矿化体系[25]。循环中CPPs和EVs是CKD中血管钙化的决定因素，通过分化和炎症应激状态调节VSMCs反应，导致矿物质沉积增加。在此过程中，GRP和FA水平的降低促进了CPPs和EVs的血管钙化作用。从生物标记物的角度来看，Viegas等人的研究结果预见EVs和CPPs在CKD诊断中的巨大应用潜力，特别是通过测定其GRP和FA含量，以提高γ-羧基化GRP生物利用度为目标可能是治疗血管钙化相关疾病的有效的途径[24]。

3 CKD患者血管钙化的防治

CKD患者血管钙化呈快速进展趋势，即呈现出一个循序渐进过程，很难逆转。综上所述，对CKD中血管钙化机制分析，血管钙化目前尚无有效的治疗方法,重点在于CKD早期防治。诸多危险因素参与血管钙化的发生和发展，除了从控制血压、糖尿病、血脂紊乱、营养不良、肥胖、吸烟等传统因素，应着重从防治高磷血症，避免高钙血症，防治继发性甲状旁腺功能亢进或低下，合理应用维生素D及类似物，防治矿物质代谢失调[26]。未来随着对CKD中血管钙化机制的深入研究,对潜在作用机制的探讨，可能出现新的CKD中血管钙化的治疗方法。