生物力纳米肿瘤学的研究进展*

曾浩文，杨祥良，2，李子福，2

(1.华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074；2.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430074)

近年来，随着纳米技术的快速发展[1]，结合多模纳米成像技术、原子力显微镜表征技术、微/纳尺度光刻加工技术所发展的纳米探针从组织、细胞乃至分子水平深入揭示肿瘤力学微环境演化；另一方面，新型纳米操作子通过对肿瘤组织或细胞进行力学干预实现肿瘤杀伤。纳米技术应用于肿瘤力学生物学所取得的突破提示生物力纳米肿瘤学作为一个新的学术方向逐渐形成。生物力纳米肿瘤学旨在运用纳米技术最新进展，结合力学和工程学的原理和方法，从基因、蛋白质到细胞、组织、器官乃至整体多层面研究肿瘤力学微环境及其调控的相关机制，为肿瘤的早期诊断、精准治疗提供新的原理和方法。肿瘤组织与肿瘤细胞涉及的生物力一般介于皮牛(pN)至纳牛(nN)级别，作用范围在纳米(nm)至微米(μm)尺度，常规检测技术很难实现精准测量，而纳米技术在肿瘤力学生物学上具备其他技术无法比拟的优势。本文拟总结生物力纳米探针与生物力纳米操作子最新研究进展，讨论生物力纳米肿瘤学所面临的挑战，并展望其未来发展方向。

1 生物力纳米探针

生物力纳米探针指能测定肿瘤组织或肿瘤细胞力学性能的纳米探针，生物力纳米探针分为两类：①可主动对肿瘤组织或细胞施加机械力，通过检测肿瘤组织或细胞受力后的反应测得肿瘤组织或细胞的力学性能；②不能主动对肿瘤组织或细胞施加机械力，但可以在肿瘤组织或细胞产生的机械力作用下产生变形，进而反推出肿瘤组织或细胞力。

1.1肿瘤组织力学性能检测 肿瘤组织异常的力学性能主要体现在“三高”：高肿瘤组织硬度、高间质液体压力和高固体应力(solid stress)[2]。肿瘤组织硬度表征的是肿瘤组织对弹性变形的阻力，液体压力主要来源于肿瘤间质液体施加的压力，而固体应力主要来源于肿瘤组织内肿瘤细胞、间质细胞以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)等固体成分[3]。检测肿瘤组织固体应力有以下3种方法：①将肿瘤块对半切开，肿瘤切面在残余固体应力驱使下变形：向外凸出意味着局部压缩力，而向内凹陷意味着局部张力；②将肿瘤切成薄片，残余的固体应力使肿瘤片在三维空间变形，此方法尤其适用固体应力小的转移灶；③利用芯针活检释放固体应力，该方法能原位检测肿瘤内部固体应力，同时离体测量癌旁组织对肿瘤组织施加的固体应力[4]。上述方法原理相同：先以可控的方式人为释放肿瘤内固体应力，然后利用超声成像技术重构切面形变并结合有限元理论计算出肿瘤组织固体应力[5]。然而，这种侵入式肿瘤固体应力测量会对机体造成损伤，借助临床现有检测仪器和技术，如磁共振弹性成像、超声弹性成像或超声横波弹性成像，新型纳米探针有望以无损的方式测定恶性实体瘤固体应力。发展能够活体、原位、实时、无损检测肿瘤固体应力的纳米探针对于阐明肿瘤转移、复发及药物治疗中肿瘤力学微环境的演化过程具有重要意义。

组织硬化是乳腺癌、肝癌等恶性实体瘤临床触诊的理论依据。不同于肿瘤固体应力的测量，生物力纳米探针在肿瘤组织硬度测量已经有重要应用。利用压电材料锆钛酸铅制备的两种生物力纳米探针提高了肿瘤针刺活检取样成功率[6]。第一种可独立工作直接用于针刺活检，第二种则可以加载到临床使用的穿刺针针头。二者均能直接对接触对象施加一定应力(σ)，通过测量接触对象在给定应力下的应变(ε)可以测得接触部位的弹性模量(E=σ/ε)。对于临床肝癌样本，这两种纳米探针通过测定弹性模量能够区分肿瘤组织(19～25 kPa)与癌旁肝硬化组织(9～11 kPa)。然而，锆钛酸铅生物力纳米探针在临床应用上具有其局限性，要求操作人员预先得知取样目标的弹性模量，另一方面，肿瘤细胞弹性模量的异质性会使探针无法区分开肿瘤细胞与正常细胞。借助原子力显微镜探针测得正常乳腺组织和良性乳腺肿瘤的杨氏模量(Young's modulus)分布均一，均值分别为1.1 kPa和3.7 kPa。然而恶性乳腺癌的杨氏模量存在三个峰值，分别为0.6，2.0和5.8 kPa[7]。杨氏模量为0.6 kPa的部位为肿瘤细胞，而5.8 kPa对应硬化的ECM。该研究表明，软的力学微环境促进肿瘤进展及转移，这与文献[8-10]报道的研究结论相悖。尽管当前无法确定肿瘤的发展及转移究竟需要软的力学微环境还是硬的力学微环境，生物力纳米探针在这些研究中的作用不可或缺。

1.2肿瘤细胞力学性能检测 肿瘤细胞力学性能异常主要体现在三方面：低细胞硬度、高牵引力和低力学性能感知。利用原子力显微镜检测细胞杨氏模量已有较多报道[7，11]，相关研究进展已经有系统性总结[12]。此外，细胞机械性能的检测方法也已有介绍[13]。当前新型生物力纳米探针在肿瘤细胞力学性能检测方面的研究进展如下。

1993年，WANG等[14]发明磁力扭曲仪，其作用原理是通过4 μm磁球对细胞施加一定应力，同时检测在应力作用下细胞产生的应变，最终由应力和应变的比值计算出细胞弹性模量[15]。利用磁力扭曲仪测得经力学筛选方法得到的肿瘤干细胞弹性模量为50 Pa，而相应的肿瘤细胞弹性模量为200 Pa[16]。此外，多电极磁镊已被用来检测人膀胱癌T24细胞的杨氏模量[17]。由于700 nm磁球可通过细胞摄取进入细胞内部，多电极磁镊能够精准测定胞内细胞质杨氏模量。利用多电极磁镊测得的肿瘤细胞长轴杨氏模量为1.5 kPa，而短轴仅为1.1 kPa，两者之间存在显著性差异。磁力扭曲仪和磁镊技术都可以通过改变磁场强度调控磁球对细胞施加的机械力，包括力的大小、方向以及频率。新型生物力纳米探针可以揭示传统检测手段无法探测的细胞内部机械性能。上述细胞力学性能检测手段均依赖于外源性纳米探针。尽管布里渊显微镜可不依赖外源性纳米探针直接测量肿瘤细胞和多细胞球体弹性模量[18-19]，但是该方法在活体肿瘤组织中的应用面临挑战。

牛顿第三定律指出，对于一个作用力，都存在一个大小相等、方向相反的反作用力，遵循这一定律，肿瘤细胞将产生作用力，简称细胞力(cell generated force)，以响应周围力学微环境的改变并维持力学稳态[20]。当前生物力纳米探针主要通过直接或间接地测定细胞力作用导致的形变，从而实现对细胞力的测量。牵引力显微镜是目前应用最广泛的测定方法[21]，其通过测定细胞力作用后的基质形变反算出细胞力[22]。该方法中基质形变的测定取决于荧光纳米粒，荧光纳米粒扮演生物力纳米探针的角色。TAN等[23]改进了牵引力显微镜，制备了由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)组成的弹性微柱生物力纳米探针。PDMS柱在细胞力作用下会逐渐弯曲变形。通过测量微柱顶面在细胞力作用下的位移量，可以计算出单个微柱所受力的方向和大小，进而得到细胞力。然而，PDMS微柱之间相互独立，细胞与柱表面不能完全接触，并不能较好地模拟细胞原位微环境。利用DNA分子张力探针[24]，LIU 等[25]发现T细胞受体(T cell receptor，TCR)与抗原结合时需要12～19 pN机械力以激活下游信号通路。该生物力纳米探针主要由修饰在金纳米粒、荧光分子以及淬灭基团标记的DNA发夹组成[26]。当探针与T细胞结合力不足以打开DNA发夹时，荧光共振能量转移以及纳米金属表面能转移双重淬灭机制会使荧光分子的荧光淬灭，探针不发出荧光[27]。当探针与TCR的结合力足以拉伸DNA发夹结构使荧光分子与淬灭基团及金纳米颗粒分开时，探针的荧光会得到恢复并能反映TCR与抗原结合时所产生的机械力。分子张力纳米探针时空分辨率高，能够在单分子水平上测量细胞力，但该探针目前仅适用二维平面培养的细胞，难以在活体组织中应用。

肿瘤细胞的力学感知能力在增殖、迁移和侵袭等过程中起着重要作用。实体瘤内的细胞受多重机械力刺激，包括静液压力、剪切应力、压应力、张力等[28]。肿瘤细胞通过细胞膜上的蛋白和细胞骨架网络将感知的机械力信号转换成生化信号，并进一步传递到细胞核内激活基因的表达。由于传统表征手段无法测量肿瘤细胞力学感知能力，基于弹性基底材料的生物力纳米探针在肿瘤细胞力学感知能力的研究上具有不可替代的作用。借助弹性基底生物力纳米探针发现，乳腺肌上皮细胞对基底刚度的感知由不同类型整合素的键动力学决定[29]。α5β1整合素在细胞表面组成型表达(constitutively expressed)，αvβ6整合素在癌症的发生和发展中选择性表达，研究提示整合素αvβ6可作为一种新的乳腺癌治疗靶标。此外，肿瘤细胞和正常细胞的刚度感知能力存在显著差异[30]。在不同软硬的PDMS柱上培养肿瘤细胞，并对细胞的刚度感知单位(contractile units，CUs)进行检测发现，由于细胞骨架蛋白水平的改变，肿瘤细胞在不同刚度PDMS柱上无法产生足够数量的CUs感知刚度刺激，并产生异常的生长信号。细胞骨架蛋白恢复正常水平，可以重新使肿瘤细胞获得刚度感知能力，进而抑制肿瘤形成。研究肿瘤细胞的机械感知能力对于揭示肿瘤细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用机制具有重要意义。

2 生物力纳米操作子

生物力纳米操作子为能够对肿瘤组织或肿瘤细胞进行力学调控的纳米颗粒或器件。生物力纳米操作子分为两类，一类通过调控肿瘤组织力学微环境中的组成成分从而改善肿瘤力学微环境，该类生物力纳米操作子不具备主动施加机械力的能力；另一类可以对肿瘤组织或肿瘤细胞施加机械力，激活力学信号通路，最终决定肿瘤组织或细胞存亡。

2.1肿瘤组织力学调控 实体瘤异常力学微环境是纳米药物递送过程的主要屏障之一，其导致纳米药物在肿瘤部位分布不均—靠近肿瘤血管部位纳米药物蓄积量高而远离肿瘤血管部位纳米药物蓄积量低。化疗不足的危害在临床已多有报道。本课题组在细胞、斑马鱼以及小鼠中证实非均质分布纳米药物导致肿瘤细胞上调转化生长因子β分泌量，加速肿瘤细胞上皮间质转化进程，促进肿瘤细胞侵袭与转移[31]。在此，笔者阐述生物力纳米操作子在调控肿瘤力学微环境，提高药物递送效率及肿瘤杀伤效果中的应用。粒径220 nm负载靶向赖氨酸氧化酶抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒在4T1小鼠乳腺癌模型中证实，该生物力纳米操纵子可以显著降低肿瘤细胞外基质的量并破坏其致密结构，最终抑制肿瘤的生长[32]。粒径19 nm铁磁性纳米粒在交变磁场的作用下可以使肿瘤温度提高至42 ℃，从而破坏胶原纤维。这使得纳米药物更容易穿透肿瘤组织，取得良好的抑瘤效果[33]。粒径100 nm包载胶原酶的脂质体可保护胶原酶在血液循环过程不会被蛋白酶降解。富集在肿瘤部位的胶原酶通过降解胰腺癌组织中的胶原纤维，提高包载紫杉醇脂质体肿瘤穿透能力及抗肿瘤疗效[34]。尽管上述生物力纳米操纵子可以显著减少胶原纤维，但是肿瘤组织的力学性能未能得到测定。研究肿瘤力学性能与肿瘤细胞外基质以及药物递送之间的关系对发展新型生物力纳米操作子具有重要价值[35]。此外，肿瘤缺氧微环境与肿瘤组织中纤维沉积密切相关，本课题组证实高压氧治疗提高肿瘤组织中氧含量，抑制HIF-1α/CTGF/ Collagen-1通路的激活，降低肿瘤组织中胶原纤维沉积量，最终提高纳米药物脂质体阿霉素肿瘤富集量与抗肿瘤疗效[36]。

2.2肿瘤细胞力学调控 近十年来，研究人员已经在单细胞层面报道了一些能够对肿瘤细胞施加机械力的生物力纳米操作子，并对其工作原理及生物医学应用进行了总结[37-38]。根据生物力纳米操纵子对细胞施加机械力后所产生的效果，可以将其细分为两类：第一类仅激活细胞力学信号通路；第二类可以杀死肿瘤细胞。磁力扭曲仪中的微米磁球可作为一种激活细胞力学信号通路的生物力纳米操作子[16]。结合三维细胞磁力扭曲仪和受激发射损耗纳米显微镜交互超高分辨三维细胞磁力扭曲系统，研究人员首次在细胞内报道机械力可以直接拉伸染色质并上调基因转录[39]。近红外光响应生物力纳米操作子由金纳米棒构成核层，聚异丙基丙酰胺水凝胶组成壳层，水凝胶外周修饰有可以和细胞表面的整合素结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽[40]。常温时，聚异丙基丙酰胺水凝胶处于舒张状态。在近红外激光照射下，金纳米棒将光能转化为热能，使聚异丙基丙酰胺高分子链受热收缩，并同时拉动RGD以及细胞表面整合素，最终对细胞施加机械力。利用DNA生物力纳米探针进一步测得每个RGD分子在收缩过程中对细胞产生了13～50 pN的机械力。微米磁球生物力纳米操作子施加机械力的大小、方向及频率可控，并且能够进行高通量细胞操控与测量[41]。但是磁球自身的重力会影响细胞表面理化性质以及力学信号通路。近红外光响应生物力纳米操作子虽然有很高的时/空间精度，但是其施加的机械力大小、方向及频率可控性有待进一步提高。

第二类生物力纳米操作子主要通过施加机械力直接杀死肿瘤细胞。表面修饰靶向死亡受体4抗体的粒径15 nm Zn0.4Fe2.6O4铁磁性纳米粒在磁场诱导下与死亡受体4结合并且聚集，从而激活下游凋亡通路，引起肿瘤细胞凋亡[42]。不施加磁场时，纳米粒虽然与细胞表面死亡受体4结合但不聚集，因此不会引发下游凋亡通路。ZHANG等[43]制备出的生物力纳米操作子和溶酶体结合后会在动态磁场发生器中旋转运动，破坏溶酶体结构完整性，导致细胞凋亡。利用相似的工作原理，研究人员利用磁场诱导铁磁性生物力纳米操作子产生机械力杀死脑癌细胞[44-45]。铁磁性纳米粒在磁场作用下组装为纳米棒，并产生超过100 pN的机械力破坏肿瘤细胞细胞膜和溶酶体膜，造成肿瘤细胞程序性死亡和坏死[46]。此类生物力纳米操作子主要通过施加磁力破坏细胞器或细胞膜的完整性，最终杀死肿瘤细胞，但其临床有效性需要进一步验证。MITCHELL等[47]将粒径100 nm PLGA纳米粒或粒径500 nm聚苯乙烯纳米粒通过化学键偶联到肿瘤细胞表面，制备了不依赖于磁力的生物力纳米操作子。该生物力纳米操作子能增强细胞膜局部受到的剪切力，进而显著提高TRAIL蛋白对肿瘤细胞的杀伤效率。相比于磁场诱导产生的磁力，生物体内剪切力的可控性更差，因此，此类生物力纳米操作子的临床转化面临更大的挑战。

3 结束语

肿瘤力学微环境与肿瘤发生发展、转移复发以及治疗息息相关，肿瘤力学生物学已经成为肿瘤生物学以及肿瘤临床转化医学的研究热点。传统研究方法面临诸多挑战。近年来，纳米技术的迅猛发展为肿瘤力学生物学的研究提供了可靠的研究手段与检测方法。笔者提出生物力纳米肿瘤学这一新的研究方向，并给出其明确定义，进一步凝练出生物力纳米探针以及生物力纳米操作子。通过实例展示生物力纳米探针在检测肿瘤组织力学性能和肿瘤细胞力学性能的具体应用。结合最新研究进展展示生物力纳米操作子在调控肿瘤力学微环境和细胞力学性能两方面的具体应用。笔者相信，对生物力纳米探针与生物力纳米操作子的深入研究将有助于揭示肿瘤异常力学微环境及其对肿瘤的发生、发展、转移、复发及药物治疗的影响规律及机制，有望为恶性实体瘤早期诊断和精准治疗带来颠覆性理论和变革性技术。