配体修饰的口服纳米载药系统的研究进展*

杨晓宇，罗寒，盛剑勇，2，万江陵，2，杨祥良，2

(1.华中科技大学生命科学与技术学院，武汉 430074；2.国家纳米药物工程技术研究中心，武汉 430074)

口服给药是一种常用、安全性高、患者顺应性好的给药方式。口服给予的药物在进入体循环前必须经过吸收的过程。由于消化道的多重吸收屏障，许多药物的口服生物利用度较低，导致口服给药的应用范围受到限制。胃肠道内丰富的消化酶可能会导致一些药物，尤其是蛋白类药物的降解；胃肠道黏膜表面的黏液层会阻碍带电荷或疏水性药物的穿透；肠上皮细胞细胞膜的亲脂性会阻碍亲水性药物通过跨细胞途径被吸收，而肠上皮细胞之间存在的紧密连接也会阻碍一些大分子药物如胰岛素通过细胞旁路途径进入基底侧。此外，药物分子被吸收的前提是溶解或高度分散在胃肠液中，因此难溶性药物的口服生物利用度往往极低。将药物活性成分包载入纳米载药系统是解决上述挑战的一种有效策略。对纳米载药系统进行配体修饰可以进一步提高纳米载药系统的上皮细胞摄取效率，从而有效提高药物的口服生物利用度。

1 口服纳米载药系统

纳米载药系统能够隔绝所包载药物分子与胃肠道内消化酶的接触，有效地保护被包载的药物不被胃肠道严苛的生理环境破坏，提高药物在胃肠道的稳定性。作为药物的载体，纳米尺度的粒子还能够快速穿透消化道的黏液层，促进肠上皮细胞的内吞，有利于同时克服口服吸收的多重屏障[1]。将难溶性药物包载入纳米载药系统，可以实现口服后在胃肠液中快速分散，进而提高难溶性药物的口服生物利用度[2]。现有研究已经积累了大量口服纳米载药系统的设计策略，如使用生物黏附性材料修饰纳米载药系统，可延长其在黏液层的滞留时间，有利于纳米载药系统穿透黏液层[3]；使用壳聚糖衍生物材料构建的纳米载药系统，可以打开肠上皮细胞间紧密连接，进而促进游离药物通过细胞旁路途径转运[4-5]。

2 受体在纳米载药系统吸收过程中的作用

消化道黏膜层细胞的摄取和转运是纳米载药系统吸收的关键过程[6]。尽管通过对纳米载药系统进行一些非特异性的修饰可以在一定程度上克服吸收屏障，然而其促吸收的效果仍有待提高[7]。

消化道黏膜层细胞表面存在多种受体，可以特异性识别胃肠道中的特定分子，进而实现对该物质的转运和吸收。受体介导的转运是许多食物中营养素的吸收途径。在受体介导的转运过程中，首先是配体与特定的细胞表面受体结合，然后受体发生聚集，细胞内陷，形成囊泡内化进入细胞。囊泡在细胞内的转运途径各异，与受体-配体结合的类型有关，可大致分为经过溶酶体的途径与不经过溶酶体的途径两大类。利用消化道黏膜层细胞表面受体介导的转运途径可以有效促进纳米载药系统的吸收。有研究表明，可以通过物理吸附或共价偶联的方法将配体修饰在纳米载药系统表面，修饰后的纳米载药系统可以与消化道黏膜细胞表面的受体结合，激发受体介导的吸收途径，从而提高纳米载药系统的细胞摄取效率和跨细胞转运效率[7-9]。例如，将纳米载药系统表面修饰叶酸后，可通过叶酸与肠上皮细胞表面的叶酸受体结合，提高纳米载药系统的肠上皮细胞摄取效率[10]。除肠上皮细胞外，消化道黏膜层中其他细胞表面的受体也可以用于纳米载药系统的转运[6-7]。纳米载药系统表面经多肽配体CSKSSDYQC (CSK)修饰后，能够与肠道内杯状细胞表面的受体特异性结合，促进纳米载药系统被杯状细胞摄取[11]。

3 配体修饰的口服纳米载药系统的种类

为了通过消化道黏膜层细胞表面受体介导的转运途径，促进纳米载药系统的吸收，国内外研究者制备了大量的配体修饰的纳米载药系统，并对这些纳米载药系统促进所包载药物口服吸收的效果进行了评价。

3.1小分子配体 小分子配体的优势在于具有较好的胃肠道稳定性，不易被降解，可通过简单的化学偶联实现纳米载药系统的修饰[8]。

3.1.1叶酸 叶酸由对氨基苯甲酸、蝶啶以及一个或多个谷氨酸键合而成，是合成核酸的重要辅酶。叶酸对维持机体正常细胞的生长和发育有着重要的作用，但机体自身无法合成叶酸，需要依赖于外源性叶酸的补充。叶酸具有生物相容性好、与叶酸受体亲和力强等优势，已被广泛用于靶向载药系统[3，10]。

将叶酸-聚乙烯亚胺(folic acid-polyethyleneimine，FA-PEI)通过静电吸附接枝到介孔碳纳米粒上，再通过溶剂蒸发法包载抗肿瘤药物紫杉醇，制备得到FA-PEI-UMCS纳米粒[12]。该纳米粒与Caco-2细胞单层孵育后，紫杉醇的表观渗透率(Papp)较紫杉醇溶液制剂Taxol增加了5.37倍，说明包载入该纳米粒后，紫杉醇穿透肠上皮细胞的能力显著提高。将载紫杉醇的FA-PEI-UMCS纳米粒灌胃给予SD大鼠，发现紫杉醇的血药浓度较Taxol显著提高，紫杉醇的相对生物利用度是Taxol的6.8倍，是未修饰叶酸的载紫杉醇PEI-UMCS纳米粒的2倍。此外，叶酸修饰提高了PEI-UMCS纳米粒在模拟胃肠液中的稳定性，使紫杉醇在模拟胃肠液中的释放减慢。包载入FA-PEI-UMCS纳米粒有效减少了紫杉醇的胃肠道毒性。

该研究表明，叶酸修饰能增强纳米载药系统在胃肠道的稳定性，更好地控制所包载药物在胃肠道中的释放，从而降低对胃肠道的刺激性与毒性。另一方面，叶酸修饰能提高纳米载药系统穿透肠上皮细胞层的能力，从而提高所包载药物的口服吸收效率。因此，该叶酸修饰纳米载药系统适合用于口服递送对胃肠道刺激性大、吸收差的药物分子。然而，叶酸修饰后对纳米载体黏液层穿透能力的影响仍有待进一步研究。

3.1.2维生素B12(VitB12) VitB12又称钴胺素，是一种水溶性维生素，对维持大脑和神经系统的正常功能起关键作用。VitB12可以与肠道上皮细胞表面的内因子(intrinsic factor,IF)受体结合。

在壳聚糖衍生物(trimethyl chitosan，TMC)纳米粒表面修饰VitB12后，用于包载胰岛素。TMC-VitB12纳米粒在Caco-2/HT29-MTX细胞模型上的摄取效率较未经修饰的纳米粒显著提高[13]。TMC-VitB12纳米粒可通过IF受体介导的内吞途径被肠上皮细胞摄取，而未修饰纳米粒则不能通过该途径被摄取，VitB12修饰可通过改变摄取途径促进纳米粒的肠上皮细胞摄取。大鼠在体肠实验结果表明，相较于未修饰VitB12的纳米粒，载异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记胰岛素(insulin，Ins)的TMC-VitB12纳米粒经回肠给药后，FITC-Ins在肠腔中的滞留量减少了59%，肠吸收增加了4.8倍。该研究表明VitB12修饰能有效促进纳米粒的肠吸收，然而该研究未对TMC-VitB12纳米粒在模拟胃肠液中的稳定性进行考察。更重要的是，该研究未考察TMC-VitB12纳米粒对所包载药物口服生物利用度的增强作用。

3.1.3生物素 生物素又名维生素B7，是一种体内无法合成的维生素，在体内的摄取通过Na+依赖的途径，其受体遍布整个肠道。有研究表明胰高血糖素样肽-1与生物素偶联后，经口服可显著增强其细胞通透性和降血糖作用[14]。

将胰岛素分别包载入生物素修饰的脂质体(biotinylated liposomes,BLP)和未修饰生物素的脂质体(conventional liposomes,CLP)。将载胰岛素的BLP和CLP分别在模拟胃肠液中孵育，发现胰岛素从BLP中的释放显著慢于CLP，说明生物素的修饰有利于提高脂质体在胃肠道中稳定性，能够更好地保护胰岛素不被消化酶降解。将载胰岛素BLP与Caco-2细胞单层孵育，胰岛素跨越细胞单层的Papp较载胰岛素CLP增加约1.85倍。载胰岛素BLP经口服给予糖尿病SD大鼠后，产生显著的降血糖效果，且该作用相对于胰岛素溶液皮下注射更为缓和，持续时间更长。口服载胰岛素BLP后，胰岛素的相对生物利用度达到8.32%，是载胰岛素CLP(3.30%)的2.5倍[15]。

该研究表明，生物素修饰可增强脂质体在胃肠道内的稳定性，更好地保护所包载的生物大分子不被消化酶降解。另一方面，生物素修饰还能促进脂质体穿透肠上皮细胞层的能力。因此，生物素修饰可增强脂质体克服生物大分子口服吸收的酶屏障和肠上皮细胞层屏障的能力。然而，该研究未考察生物素修饰对脂质体BLP穿透消化道黏液层能力的作用，生物素修饰是否有利于脂质体克服生物大分子口服吸收的黏液层屏障有待进一步研究。

3.1.4氨基酸 氨基酸与蛋白质相比更为稳定，更易偶联至纳米粒表面。有研究表明缬氨酸偶联的药物可以通过寡肽受体介导的内吞进入细胞，显著提高细胞对药物的摄取效率[16]。

将缬氨酸偶联至PLGA纳米粒表面，用于载胰岛素，制备得到缬氨酸载药纳米粒。将载胰岛素的缬氨酸纳米粒和未经缬氨酸修饰的纳米粒分别置于模拟胃液中孵育2 h，再于模拟肠液中孵育3 h后，胰岛素的释放百分率均约10%，说明缬氨酸修饰未对纳米粒的胃肠道稳定性产生显著影响。载胰岛素缬氨酸纳米粒的离体肠实验结果表明，给药60 min后，胰岛素的穿透比例高达91%，显著高于未经缬氨酸修饰的纳米粒(48%)。在糖尿病家兔的药效及药动实验中，载胰岛素缬氨酸纳米粒灌胃后，胰岛素的Cmax为(124.92±20.77) ng·mL-1；未经缬氨酸修饰的纳米粒灌胃后，胰岛素的Cmax为(112.22 ± 16.95) ng·mL-1，两者降血糖效果和Cmax的差距明显小于离体肠吸收实验中的穿透率。这种差异可能原因是缬氨酸修饰对纳米粒穿透黏液层的效率产生了显著性影响。虽然缬氨酸纳米粒在离体肠实验中展现出了很好的促胰岛素吸收潜力，但是药动学研究并未对载胰岛素缬氨酸纳米粒口服后胰岛素的药理相对生物利用度及相对生物利用度进行计算。

3.1.5半乳糖 半乳糖是哺乳动物乳汁中乳糖的组成成分，在肠道中能够快速吸收。半乳糖的肠吸收由Na+-葡萄糖共转运体SGLT1介导[17]。在纳米粒表面修饰半乳糖后，可以通过该途径介导的内吞作用提高纳米粒的细胞摄取效率。

将伊马替尼(imatinib，IMT)载入半乳糖修饰的PLGA纳米粒，制备得到IMT-GNP，包封率93.06%，平均粒径122 nm[18]。将未经半乳糖修饰的载IMT PLGA纳米粒(IMT-NP)和IMT-GNP分别置于磷酸盐缓冲液(PBS)中孵育，IMT-GNP的IMT释放速率显著低于IMT-NP。然而，该药物释放实验未使用含消化酶的模拟胃肠液作为释放介质，因此仍无法预测半乳糖修饰对纳米粒在胃肠道中稳定性和体外释放的影响。Caco-2细胞摄取实验表明，IMT-GNP的肠上皮细胞摄取效率显著高于IMT-NP，这可能是半乳糖修饰增加了纳米粒入胞的途径所致。相较于IMT-NP，细胞对IMT-GNP的摄取增加了网格蛋白介导的内吞途径以及SGLT1介导的内吞途径。将DiO标记的IMT-GNP或IMT-NP分别灌胃给予SD大鼠1 h后，发现IMT-GNP组的小肠黏膜内荧光强度显著高于IMT-NP组，说明IMT-GNP纳米粒具有更强的肠上皮通透性。将IMT-GNP灌胃给予SD大鼠后，IMT的生物利用度较IMT混悬液增加了1.52倍，而IMT-NP灌胃给予SD大鼠后，IMT的生物利用度较IMT混悬液仅增加了1.15倍。这说明纳米载体的半乳糖修饰能显著提高所包载IMT的口服生物利用度。

3.2蛋白多肽类配体 目前已发现一些天然来源的多肽或蛋白质能够与消化道上皮细胞表面受体特异性结合[9]。依托海量的蛋白和多肽数据库，以及分子对接等计算机模拟技术，可以对多肽蛋白配体的序列和结构进行优化，在保持高受体-配体结合常数的前提下，降低配体的分子量，提高配体的稳定性。目前的化学技术已能基本满足各种氨基酸序列多肽的高通量快速合成，为多肽配体在纳米载药系统中的应用奠定了基础。

3.2.1封闭带毒素(zonula accludens toxin，ZOT)来源的多肽 ZOT是一种来源于霍乱弧菌的毒素，可以特异性与消化道上皮细胞表面的ZOT受体结合，其结合位点位于ZOT的118-299氨基酸。包含该段氨基酸序列的多肽同样可以与ZOT受体结合。ZOT或ZOT来源的多肽与受体结合后，可以通过激活一系列细胞间的级联反应来调节上皮细胞的膜结构，可逆性增强上皮细胞的通透性，从而促进大分子物质的吸收[19]。

以ZOT来源的多肽AT-1002(FCIGRLGGGGGC)和壳聚糖对载胰岛素纳米粒进行双功能化修饰，双修饰纳米粒促进胰岛素口服吸收的效果优于AT-1002或壳聚糖单修饰的纳米粒[20]。Caco-2细胞单层转运实验表明，AT-1002和壳聚糖修饰对于打开肠上皮细胞间紧密连接有协同作用。Caco-2细胞单层的跨膜电阻值会在结束给药后的2 d内恢复，表明AT-1002与壳聚糖对于细胞间紧密连接的作用具有可逆性。将包载胰岛素的AT-1002和壳聚糖双功能修饰纳米粒灌胃给予糖尿病SD大鼠，给药10 h后血糖浓度降低至初始值的60%以下，降血糖效果显著优于载胰岛素的AT-1002或壳聚糖单修饰纳米粒。

对纳米载药系统进行AT-1002和壳聚糖双修饰能有效提高所包载药物穿越上皮细胞层的效率。然而，产生促吸收效果的机制可能不仅仅局限于打开细胞间紧密连接。对纳米载药系统进行双修饰可能在不同吸收过程或通过不同作用机制产生协同的促吸收作用。因此，对双修饰纳米载药系统的促吸收过程进行更为系统地研究，可以对各种修饰比例的优化提供依据。

3.2.2穿膜肽 细胞穿膜肽是一类具有强跨膜转运能力的小分子肽，通常带有正电性，可通过物理结合或化学偶联携带小分子或大分子药物进入细胞。已有研究使用穿膜肽修饰纳米粒以提高其细胞摄取率[9，21-23]，常用的穿膜肽有TAT肽(反式激活转录肽)、低分子量鱼精蛋白、精氨酸八聚体(R8)等。

ZHU等[24]发现，纳米粒经穿膜肽TAT、R8、penetratin修饰后均能有效地增强Caco-2细胞的摄取，其中penetratin修饰纳米粒的细胞摄取效率相对于未修饰的纳米粒提高了1.92倍，效果显著优于TAT修饰的纳米粒(提高1.80倍)及R8修饰的纳米粒(提高1.56倍)。将载香豆素-6穿膜肽修饰的纳米粒与Caco-2细胞单层孵育后，香豆素-6的Papp较未修饰的纳米粒组均显著提高。其中载香豆素-6的penetratin修饰的纳米粒Papp高达5.45×10-6cm·s-1，显著优于TAT、R8修饰的纳米粒。

纳米载药系统表面的带电性是其穿透黏液层和穿越肠上皮细胞层的重要影响因素。TAT、R8、penetratin这3种穿膜肽的修饰均能促进纳米载药系统跨越上皮细胞层，这可能得益于穿膜肽所带正电荷使之更易与带负电的肠上皮细胞层发生静电吸附。然而上述研究均未对穿膜肽修饰纳米载药系统穿透黏液层效率进行研究。

3.2.3凝集素 凝集素是一种特异识别并结合糖的蛋白质或糖蛋白。凝集素与糖基的相互作用在生物体中广泛存在。凝集素可以识别肠上皮细胞表面的蛋白与脂质糖基化位点并与之结合，并将信号传导至细胞内，诱导细胞内吞及胞内转运[25]。

将紫杉醇载入凝集素偶联的固体脂质纳米粒中，制备得到的LPSN纳米粒，包封率(91.3±1.2)%[26]。药动学实验表明，健康Wistar大鼠口服LPSN纳米粒后，紫杉醇的相对生物利用度达到30.3%，是未修饰纳米粒(PSN)组紫杉醇相对生物利用度的1.9倍。该研究者推测LPSN通过促进M细胞摄取的机制产生促吸收作用，但该研究未对该推论进行直接验证。Wistar大鼠口服载紫杉醇LPSN纳米粒后，紫杉醇在肺部的蓄积量是PSN的2.6倍。该研究者认为LPSN纳米粒可能具有口服肺靶向的特性，然而并未考察口服载紫杉醇LPSN纳米粒后紫杉醇被吸收入血后的形式，究竟是以游离药物还是以纳米粒的形式存在，以及两种形式的比例。因此，载紫杉醇LPSN纳米粒口服后促进紫杉醇在肺部分布的机制仍需要进一步研究。

3.2.4其他 整合素受体是一类表达在Caco-2细胞上的跨膜糖蛋白。FQS肽(FQSIYPpIK)是从PNA编码多肽数据库中筛选出来的，与整合素受体具有高亲和力的多肽[27- 28]。以FQS肽改性的三甲基壳聚糖为原料，制备得到载胰岛素纳米粒FQS-NP。FQS-NP能够显著促进Caco-2细胞对纳米粒的摄取，其细胞摄取效率是未修饰的纳米粒T-NP的1.84倍，是游离胰岛素的4.7倍。进一步研究发现， FQS-NP相对于T-NP增加了网格蛋白介导的内吞途径进入肠上皮细胞，这可能是其细胞摄取效率提高的原因。将FQS-NP灌胃给予糖尿病SD大鼠，血糖浓度可下降至初始值的55.9%，其降血糖效果显著优于未修饰纳米粒T-NP[28]。

EGP肽(KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK)与硫酸肝素蛋白多糖有高度亲和性，可作为靶向肽用于口服纳米载药系统的修饰。EGP肽修饰纳米粒的细胞摄取效率高达未修饰纳米粒的4.5倍，在Caco-2细胞单层上的转运效率高达未修饰纳米粒的4.2倍，表明EGP肽修饰能够有效地促进纳米粒穿透肠上皮细胞层[29]。

研究发现，低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)在肠道细胞中高表达[30]。因此，可寻找与LDLR受体特异性结合的多肽用于纳米载药系统的修饰。有研究发现P22肽(NH2-C6-[cMPRLRGC]c-NH2)与LDLR受体有高亲和力[31]。P22肽修饰纳米粒(P22 NP)的Caco-2细胞摄取效率是未修饰纳米粒(PLNP)的2.5倍，Caco-2细胞单层转运效率是PLNP的1.4倍，表明P22多肽修饰可以促进纳米粒的口服吸收。P22多肽修饰后，纳米载体的细胞摄取效率和穿细胞单层转运效率显著增强，但是P22修饰对前者的增强作用明显大于后者。这说明，P22修饰可能会削弱纳米载体的胞内转运效率，使之易被肠上皮细胞摄取，但是在穿透肠上皮细胞入血的过程中遇到瓶颈。经进一步研究发现部分P22修饰纳米粒被困于溶酶体内，阻碍了其向胞外的转运，使摄取容易但穿透难。为解决这一问题，研究者将二甲双胍和血凝素-2与载药P22修饰纳米粒共给药，促进P22修饰纳米粒的溶酶体逃逸，提高细胞单层穿透性。将载胰岛素的P22 NP灌胃给予糖尿病大鼠后，胰岛素的药理相对生物利用度PA达到5.33%，是未经修饰PLNP的1.4倍。在给药的同时，给予二甲双胍和血凝素-2，可使胰岛素的药理相对生物利用度进一步提高，达到PLNP的1.8倍。

该研究揭示了配体修饰对于纳米载药系统胞内运行效率的影响。该科学问题在配体修饰口服纳米载体的既往研究中鲜少涉及，但是非常重要，需要在后续研究中引起重视。后续研究中，可针对胞内转运途径和效率，进一步优化配体修饰纳米给药系统中配体分子的选择、结构和修饰密度。

4 结束语

纳米载药系统在克服口服吸收多重屏障，提高所包载药物的口服生物利用度方面具有独特的优势。通过利用配体与消化道上皮细胞表面受体结合促进自身吸收的特性，研究者设计了大量配体修饰的纳米载药系统用于口服药物递送，也在细胞或动物水平证明了配体修饰确实可以提高纳米载药系统或所包载药物的吸收。然而，现有研究却鲜少涉及配体修饰纳米载药系统的细胞摄取机制和促吸收机制。配体修饰对纳米载药系统理化性质的影响是多方面的，既可能影响粒径、表面电位，也可能改变纳米载药系统的表面亲疏水性。而这些理化特性的变化也会对纳米载药系统的口服吸收效率产生影响。因此在研究配体修饰促进纳米载药系统口服吸收的作用机制时，需要区分配体与受体结合产生的促吸收的作用和通过影响理化性质所起的作用。另一方面，口服吸收的过程较为复杂，至少包括消化道上皮细胞摄取、胞内转运、基底侧出胞这几个过程。目前对配体修饰纳米载药系统的研究大多局限于细胞摄取的阶段，而对配体修饰在后几个生理过程中的作用了解甚少。相信后续在这两方面研究的开展可设计出更理想的口服纳米载药系统，进一步提高纳米载药系统的促吸收效果，拓宽口服纳米载药系统的应用。