UPLC-MS/MS在中药材农残分析中的应用

孙仟，林林，郭东晓，林永强

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室，山东 济南 250101)

随着中药材市场的扩大，野生中药材已经难以适应当前的市场环境，中药材生产依赖栽培种植已是大势所趋。农药能在相当程度上减轻病、虫、草害对中药材产量及质量的影响，大量的栽培种植就必然涉及农药的使用。农药残留是使用农药后残存于生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称[1]。在中药材的栽培种植过程中所涉及的农药多达几百种，除常见的有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类农药外，卤代烷类、氟制剂、取代苯类[2]、微生物制剂及激素类等农药也有广泛的使用。

目前对农药残留的监控以制定各个农药的最高残留限量和开发准确快速的定性定量方法为重点，随着现代农药检测分析技术的发展，针对痕量多残留的快速检测已然成为现代农残检测研究的发展方向[3]。对于农药残留的检测所使用的方法目前主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管区带电泳法(CZE)和免疫分析法等[4]，不同的方法有各自的特点，本文重点论述的超高效液相色谱-串联质谱技术(UPLC-MS/MS)是一项基于HPLC-MS/MS发展起来的分析技术。

HPLC-MS/MS在20世纪90年代就已发展成熟，此技术弥补了高效液相检测器灵敏度不足的缺陷，以其选择性高和检测限低的优势而成为现代实验室日常使用的一种快速、准确的分析工具[5]。HPLC-MS/MS突破了HPLC检测的局限性，在中药材农残检测方面也得到了很好的应用和发展[6-8]，而UPLC釆用小粒径填料色谱柱，配合超高压系统，柱效更高，灵敏度更高，分析通量更大，并且其超强的分离能力有助于将目标化合物和竞争电离的杂质进行分离,从而减弱甚至克服MS检测器因离子抑制而灵敏度降低的问题，使UPLC成为MS检测器的最佳液相色谱入口[9]，而MS技术一向有高特异性和高灵敏度的突出优势，两项技术“强强联手”的搭配，使UPLC-MS/MS展现出卓越的定性、定量分析能力及强抗干扰能力，十分适合中药材农残测定这类复杂样本中的多种低含量目标物同时分析的情况。

本文将综述UPLC-MS/MS在中药材农残分析中的应用现状，对目前此技术联用的关键步骤进行总结、介绍和比较，对基质效应的产生和应对方法进行分析，并展望了UPLC-MS/MS在中药农残检测中的应用前景。

1 UPLC-MS/MS技术在中药材农残检测研究中的应用

UPLC-MS/MS作为一项通用检测技术，目前在检测氨基甲酸酯类[10]、有机磷类[11]、拟除虫菊酯类[12]、三嗪类除草剂[13]和新烟碱类杀虫剂[14]等各类农药过程中都取得了较为理想的结果，使用该技术检测中药材中农残的试验步骤基本由以下几个方面依次展开，首先根据农药的使用情况及具体试验情况选择出目标物；优化前处理方法，并根据目标特色进行提纯净化；选择合适的色谱柱及洗脱程序分离样本；优化质谱条件，进行稳定性、精密度、回收率等方法学验证，最后对目标物进行高灵敏度的定性定量分析。以下也将以这样的顺序对UPLC-MS/MS在中药材农残分析中的应用现状进行综述和分析。

1.1 样品前处理 样品前处理是对样品进行提取和除杂，获得符合检测要求的检测样本以进行定性、定量分析检测的步骤。中药材成分十分复杂，杂质干扰问题严重，农药残留浓度极低，合适的前处理方法能最大限度地去除干扰物，提取待测物，减少对检测仪器的污染，精确定量，选择的前处理方法是否合适将直接关系到试验结果的成败。目前，UPLC-MS/MS对中药材中农药多残留分析使用的前处理技术主要有固相萃取技术(SPE)、分散固相萃取技术(DSPE)、基质固相萃取技术(MSPD)、溶剂萃取技术(SE)及凝胶渗透色谱技术(GPC)等。

DSPE技术又被称为QuEChERS技术，此技术由美国农业部农业研究服务中心的 Anastassiades 等[15]于2003年开发，而后又于2005年引入了针对酸碱敏感农药的右酸缓冲盐体系[16]，此方法对大多数农药均能进行较高质量的提取，已经成为世界各国残留分析技术的模板[17]，亦是目前UPLC-MS/MS在检测中药材中农残领域应用最多的一种前处理方法。其基本原理基于SPE技术,操作步骤可以简单归纳为：①以纯乙腈、含1%乙酸乙腈溶液或含水乙腈等对样本进行初步的提取分离；②以氯化钠、无水硫酸镁或无水醋酸钠等盐进行盐析、取上清；③加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨炭黑分散固相萃取剂(GCB)等吸附剂填料吸附基质中的杂质对样本进行净化除杂；④离心、滤过，对上清液进行分析检测[18]。此方法灵活性强，实验人员可以根据具体的药材及目标物的性质对提取剂，吸附剂及用量等条件进行变化调整，或与其他方法联合使用，以取得最佳的试验结果。

Wu等[19]使用酸性乙腈对补充过水分的人参样品进行萃取，使用无水硫酸镁吸收多余的水分，在对5种纯化方案进行筛选后，采用了PSA(100 mg)+C18(100 mg)+GCB(50 mg)的搭配对样本进行纯化，在使用UPLC-MS/MS法同时检测人参中27种农残的试验中取得了较基质固相萃取(MSPD)等方法更优的试验结果。

Yang等[20]使用乙腈为萃取剂，对4种不同吸附组合的净化效率和萃取回收率进行对比，采用了PSA(20 mg)+Al2O3-N(50 mg)+GCB(20 mg)组合吸附剂纯化样本，结合最适合于固体和半固体样品的加速溶剂萃取技术(ASE)，研究了一种使用UPLC-MS/MS法分析甘草样本中15种氨基甲酸酯类农药残留的新方法。试验将此方法与液-液萃取法(LLE)、凝胶渗透色谱法(GPC)和固相萃取法(SPE)进行了比较，发现此方法有试验时间短和试剂使用量少的优势。

李家春等[21]使用含1% 醋酸的乙腈为萃取剂对含水量进行过调整的中药材进行提取，以无水硫酸镁及无水醋酸钠进行盐析，采用了无水硫酸镁(360 mg)+PSA(60 mg)组合吸附剂对样本进行纯化除杂，结合UPLC-MS/MS为三七、川贝母、薏苡仁、桂枝和金银花5种中药材中的35种有机磷类农残提供了快速检测的方法。

还值得注意的一点是提取溶剂并不一定适合进样，为优化出峰时间和峰形，往往需要再经试验挑选出最适合的复溶溶剂。李娜等[22]在测定中草药中氨基甲酸酯类农药残留量的试验中将样本以乙腈提取，丙酮-正己烷(20∶80)溶解，净化后选择流动相作为复溶液，以甲醇-0.1%甲酸(40∶60)进行复溶；而李娜等[23]在以UPLC-MS/MS测定黄芪中有机磷类农药残留量的试验中同样以乙腈为提取溶剂，但在对峰形，溶解度和响应值多方面考察后，定容溶剂选用了甲醇-0.1%甲酸(60∶40)进行定容。

1.2 色谱及质谱条件 在色谱方面，目前针对此领域的试验多选择C18色谱柱，再根据各类中药材本身的性质及农残类型的不同，使用甲醇-水体系或乙腈-水体系的流动相进行梯度洗脱，为了进一步改善峰形和提高灵敏度,流动相中往往会添加低浓度的甲酸、甲酸铵或乙酸铵等，一方面能起到抑制不稳定的弱酸或弱碱性农药分解的作用，另一方面还能起到提高离子化效率的作用。

样本中各成分经UPLC分离后进入MS系统，中药材农残的检测目前最普遍的方法是使用三重四极杆质谱仪以多反应监测(MRM)方式对试验样品进行扫描。具体方法为首先对目标农药的标准品溶液进行全扫描,得到一级质谱图，确定母离子后再进行二级质谱全扫描，采集全扫描的二级质谱图,找到两个或两个以上子离子进行定性和定量，最后，对碰撞能量、碰撞室出口电压等质谱参数进行优化，调整灵敏度至最佳水平。

中药材中基质复杂，试验目的又多是同时检测体系中多种含量极低的目标化合物，MRM模式可以有针对性地选择数据进行质谱信号采集，灵敏度高，选择性也高，十分适合于中药材中检测农残，就目前所查资料，除考虑方法普适性，对单个反应监测模式(SIM)偶有应用[11]外，此类试验几乎均采用此模式检测。三重四极杆质谱仪是进行单一质荷比扫描最灵敏的一类质谱系统，同时也最适合进行MRM分析，因此，此类试验也多选用了此种搭配。

电喷雾电离源(ESI)的检测限低，灵敏度高，应用范围广，成为UPLC-MS/MS检测中药农残的优先之选，大量的试验也证明了此类离子源十分适合农残类痕量样本的分析。

ESI源和大气压化学离子源(APCI)均为常用的喷雾型软电离液质接口系统，不同的是ESI源的特点是主要适用于极性、大分子有机物，易形成多电荷离子，挥发或不挥发的溶质均可使用；而APCI源更多的适用于弱极性化合物及小分子有机物，能获得良好的结构信息，有试验比较二类离子源发现APCI源较ESI源受基质效应的影响更小，但在灵敏度方面APCI源较ESI源要低[24]，在适合类型的农残检测试验中APCI源也是一项可供考虑的选择。在查询资料过程中还发现在食品中农残分析领域对大气压下的阈值光电离源(APPI)也有应用,有研究以此离子源对氨基甲酸酯类农药残留进行了检测，效果较为理想。APPI源的原理与APCI源类似,适用于检测非极性化合物及低极性化合物，弥补了ESI源和APCI源都不适合的非极性化合物空缺，而且APPI源受基质效应的影响也比较小,还可以省去农残检测过程中基质校正的步骤,简化试验过程,扩大技术应用范围[25]，但目前在近期针对中药材领域的此类研究中没有发现相关应用。

另外，由于目标物在正离子模式下更易形成稳定的分子离子峰，正离子模式采集普遍较负离子模式采集效果更优，故此类试验鲜有使用负离子模式采集的例子，除少数试验选择了采用正负离子同时扫描的模式[26]外，都优先选择了正离子模式进行测定。

吴国利等[27]使用UPLC-MS/MS对槟榔中的10种理化性质有较大差别的农药残留进行同时测定，选用Hypersil Gold C18色谱柱，以0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱，在ESI模式下采用正离子模式以MRM方式进行数据采集，对20种市售的槟榔制品中的10种农残进行了精确的检测。

张玉婷等[28]采用UPLC-MS/MS对人参、黄芪中55种除草剂进行了同时测定，选用Acquity BEH C18色谱柱，同样以0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱，在ESI模式下采用正离子模式以MRM方式进行数据采集，建立了对人参、黄芪中12类除草剂残留进行精确检测的方法。

不难看出目前QuEChERS前处理加UPLC与三重四极杆质谱仪联用几乎成为UPLC-MS/MS进行中药材中多农残分析的常规方法，此方法有普遍适用性和高效性。在此方法之外，针对中药材中农药残留的检测也存在不同的尝试。

Su等[11]使用多壁碳纳米管等材料制成微型萃取膜，联合溶剂萃取的方法对人参进行了前处理，采用UPLC、ESI源和四极轨道质谱仪在target-MS2模式下同时对人参中19种有机磷类农药残留进行了分析。不仅通过简单有效的前处理过程一步完成了对分析物的提取和净化，分析结果也获得了较好的线性和回收率，是此类方法的一次成功应用范例。

2 基质效应

基质效应是指基质中的共提取物组分干扰对目标化合物的分析，产生基质增强作用或基质抑制作用，最终对分析结果的准确性产生影响。中药材为复杂基质样本，农残含量低，基质效应尤为严重，在此类试验中，基质效应是一项难以规避的问题。针对不同样本不同程度的基质效应，使用的方法也不尽相同，目前在具体试验中往往采用优化前处理方法，使用基质匹配标准溶液校正及同位素内标法补偿等方法进行减弱或修正。

2016年，秦瑶等[29]应用UPLC-MS/MS测定生脉饮及其原料药中的 19 种农残，在计算基质效应后发现在生脉饮，麦冬，党参中存在不同方向不同程度的基质增强和抑制效应，于是选择用基质标准溶液对定量的结果进行校正，试验结果符合多种农药残留的分析要求。

2013年，由于所测样本组成范围广，难以获得与样品成分相似的空白样品，Mao等[13]成功在不使用基质标准溶液校准的情况下，使用分子印迹聚合物(MIPs)作为选择性固相萃取吸附剂，通过构建凝胶渗透色谱法(GPC)与分子印迹固相萃取技术(MISPE)相结合的方法对样本进行前处理，使用UPLC-MS/MS对黄芪、人参、山药、丹参、金银花及马钱子中的23种三嗪类农残进行了分析。

2018年，林永强等[30]在以UPLC-MS/MS法测定瓜蒌中156种农药残留的试验中，由于瓜蒌中油脂类成分含量较高，试验结果受基质效应影响严重，使用QuEChERS 的方法净化基质效应后结果不佳，最终选择了以固相萃取技术(SPE)与QuEChERS 结合净化的前处理方法，同时在试验中采用了同位素内标加入的方法对基质效应进行了补偿，最终取得了理想的试验结果。

3 UPLC-MS/MS在中药材中农残检测领域的研究展望

比较最近的三版《中国药典》(2005年版、2010年版、2015年版)可以发现，我国在中药安全性质量控制方面有十分明显的完善，在新版《中国药典》中已经收录了农药多残留的检测方法，我国已在不断进步中与国际领先检测管控比肩，虽有不足，但趋势利好。

目前UPLC-MS/MS技术在各个领域已经得到了较为广泛的应用，也越来越多地应用于对中药材中农药残留进行分析，此技术尤其适用于复杂样本体系中对多种目标化合物进行快速定量，分析效率极高，在提高检测准确性的同时也极大地节约了时间和试剂成本，是一项适合目前应用要求，符合领域发展方向的技术。时至今日，此技术在中药材中多农残分析领域内的应用已趋于成熟，已经可以同时精确检测中药材中的百种农残，但在查询相关文献过程中发现仍是存在新研究较少，基质效应问题难以克服的问题，且仪器成本较高，影响方法使用的普及性。相信随着仪器的革新和更多的试验经验积累，UPLC-MS/MS技术将会更加充分的发挥它的独特优势辅助中药农残分析检测的发展。

本文对近期相关应用进行了归纳，以期为UPLC-MS/MS技术检测中药材中多农残的研究提供参考，辅助中药材安全性研究及应用，使中药材农残检测更规范，高效，环保。只有针对不同的农药性质及限量，综合中药材本身性质选择最佳的检测方式进行检测，辅助科学合理地制定用药规范，限制中药材的外源性污染，倒逼生产端合理使用农药，才能达到减少环境污染，保证用药安全的目的。