中性粒细胞胞外诱捕网及其参与的免疫炎症性疾病研究进展

刘春晓，胡庆华

(中国药科大学药学院，江苏 南京 211198)

中性粒细胞是人体固有免疫系统中含量最丰富的一类先天免疫效应细胞，具有广泛的免疫活性。中性粒细胞能够通过吞噬作用、氧化应激以及形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)的方式参与机体免疫[1]。NETs是由中性粒细胞产生的一种以DNA为基本骨架表面附着有组蛋白、胞质蛋白、蛋白酶和其他颗粒蛋白的一种纤维网状结构，中性粒细胞产生NETs并伴随着细胞裂解死亡的过程被称为NETosis。尽管如此，亦有报道显示并非所有NETs的释放都伴随着细胞的裂解死亡，在革兰阳性菌感染的早期，可以观察到非裂解性的NETs 释放，即NETs释放但不发生细胞的裂解死亡。NETs能捕获并帮助消除细菌、真菌、病毒或寄生虫等病原体[2-5]。然而某些情况下，过度的炎症反应反而会损害宿主并导致组织功能障碍[6-7]。

本文主要综述了中性粒细胞NETs的形成调控机制、NETs在一些免疫炎症性疾病中的病理作用，总结了干扰NETs形成的小分子化合物以及可能通过调节NETs产生起到治疗疾病作用的药物。

1 NETs的形成和调控

1.1 NETs的形成 NETs的形成与活性氧(reactive oxygen species，ROS)途径密切相关，其中NADPH氧化酶与中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在NETs的形成过程中发挥着重要的作用。NADPH氧化酶产生的ROS激活髓过氧化物酶(MPO)触发NE从嗜酸性颗粒活化转运到细胞核，NE水解染色质上的组蛋白，使染色质去组装成为游离的DNA[3,8]。然而NADPH氧化酶并不是NETs形成所必需的，有报道显示，在免疫复合物诱导的NETs形成中，线粒体的ROS足以驱动NETs形成，不需要NADPH氧化酶的参与[2]。而在系统性红斑狼疮(SLE)中NADPH氧化酶及线粒体产生的ROS均参与了NETs的形成过程，NADPH氧化酶功能的缺失将导致对线粒体ROS依赖的增加[9]。MPO-NE途径参与包括真菌和晶体在内的多种刺激物诱导的NETs形成过程[10-11]，MPO缺陷[12]及NE缺陷[13-14]已被证明可以在多种疾病模型中抑制NETs的形成，而NADPH氧化酶缺陷也被报道可以在肺部真菌感染期间抑制NETs的生成[15]。

肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD4)是NETs形成过程中另一重要的功能蛋白，PAD4通过驱动组蛋白脱氨或瓜氨酸化参与染色质去组装的过程[16-17]。在NETs形成的过程中，PAD4位于ROS信号传导的下游，不同刺激物激活的PAD4对组蛋白瓜氨酸化的程度和特异性也有所不同[18-20]。目前，关于PAD4能否在NE缺陷型小鼠中性粒细胞中独立诱导染色质的去组装还没有明确的报道，但NE的抑制剂可以在肺部真菌感染的过程中阻止染色质的去组装而不干扰组蛋白的瓜氨酸化[21]。总之，这些蛋白酶的药理学抑制作用会在各种情况下阻止染色质的去组装，而它们同时也是药理学中NETs检测中的重要指征。

1.2 NETs的调控 在NETs形成的过程中，ROS上游的调控通路尚未完全明晰，已知被报道的有多种ROS的诱导受体(BOX1)和激酶，如MEK(MAPK/ERK激酶)、细胞外信号调节激酶(ERK)、IL-1相关激酶(IRAK)、PKC以及磷酸激酶3-激酶(PI3K)等[22-25]。其中PI3K的发现提示我们自噬可能也参与了NETs的调节，因为PI3K在自噬途径中也发挥着关键性的作用。有研究发现，在缺乏自噬相关蛋白ATG7的中性粒细胞中NETs的生成被部分抑制[26]，而针对自噬通路关键蛋白mTOR的靶向抑制雷帕霉素同样也对NETs有抑制作用[27]。ROS能够诱导自噬的发生，而自噬的发生又维持了ROS的爆发并协助氧化应激，提示NETosis与自噬之间存在潜在的联系[28-29]。

病原体的大小也是NETs形成调控过程中的一个重要因素。中性粒细胞对病原体大小的感知决定了NETs形成和吞噬作用之间对NE的竞争。这种机制使得中性粒细胞能够针对大型病原体产生NETs，而针对小型病原体发生吞噬作用并抑制NETs[21]。当病原体体积较小时，病原体被吞噬体吞噬，该吞噬体与嗜酸性颗粒融合，从而阻止染色质去组装。而当病原体过大而无法被吞噬体摄取时，NE可进入细胞核并驱动NETs。然而，也有研究报道了关于小细菌引起NETs的情况，牛分枝杆菌卡介苗通过形成聚集体的方式驱动NETs形成[30]，而淋病奈瑟氏球菌则通过延迟吞噬体与嗜酸性颗粒的融合诱导NETs[31]。总之病原体可以通过多种机制调节NETs形成，已知的影响因素包括体积大小和毒力因子的表达。

2 NETs与疾病

NETs在机体中有着杀死病原体和造成宿主损伤的双重作用。一方面，当发生较大的病原体感染时(比如真菌菌丝)，NETs发挥着主要的抗菌作用[21,32]。在人群中，MPO缺乏症的患者会出现反复的真菌感染症状引起慢性肉芽肿(CGD)，而对CGD患者给予药物诱导ROS的产生促进NETs形成，可以恢复其中性粒细胞清除念珠菌分生孢子和菌丝的能力[33]。NETs在白色念珠菌性角膜炎中也发挥了重要的免疫作用，使用糖皮质激素进行治疗会影响中性粒细胞的浸润和NETs的形成从而加剧真菌性角膜炎[34]。在寄生虫相关的疾病中，NETs通过捕获和杀灭入侵的寄生虫发挥免疫作用。研究显示，NETs通过影响寄生性吸虫幼虫的迁移促进免疫系统对寄生性吸虫的消灭[35]。而在钩虫感染中，虽然NETs也能够在体外杀死钩虫幼虫，但钩虫幼虫能够通过分泌脱氧核糖核苷酸酶逃脱中性粒细胞的免疫作用[36]。另外NETs也在抵御对中性粒细胞其他抗菌途径有破坏作用的剧毒细菌中起着关键作用，NETs可以降低HIV病毒粒子的感染性，而DNase I处理的NETs则不具备这种功能[37]。

另一方面， NETs还参与了许多疾病的病理过程，在严重流感病毒感染期间，NETs的释放会造成组织损伤和细菌过度生长，而通过抗体耗竭中性粒细胞或DNase Ⅰ 的干预可以降低小鼠的死亡率[38]，近期研究也显示，在登革热感染过程中，脾脏中NETs的沉积与血管通透性和病毒的致死性密切相关[39]。NETs还参与了血小板活化及血栓形成过程，因此与卒中、动脉粥样硬化和抗磷脂综合征等疾病的发病密切相关[40-42]。随着对NETs研究的深入，与NETs相关的病理机制也不断地被发现，尤其是在各种免疫炎症性疾病中由于NETs过度产生导致的组织损伤。本章重点介绍与NETs相关的涉及的各种免疫炎症性疾病的病理学过程。

2.1 NETs与感染性炎性疾病 败血症是细菌等病原微生物在循环系统中大量繁殖而引起的一种全身感染性疾病，具有很高的致死率。当败血症发生时，血小板Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)响应病原体与中性粒细胞结合并介导其放NETs并随循环系统转移到其他组织和器官[43]。NETs在败血症中主要起有害作用，NETs与耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌引起的败血症对肝的损害有关，这种损害可以被NE或PAD4敲除所抑制[44]。在败血症中，循环系统中的组蛋白能够破坏细胞膜完整性，在实验中用抗体中和组蛋白后，NETs引起的组织损伤明显减弱，表明NETs结合的组蛋白在NETs介导的细胞毒性作用中起着核心作用[45]，NETs还与败血症引起的弥漫性血管内凝血密切相关[46]。

2.2 NETs与肺部炎症性疾病 NETs与肺部炎症性疾病关系密切，肺部在病理状态下可以募集大量的中性粒细胞，而中性粒细胞产生的NETs也参与了多种肺部疾病的病理过程[47]。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种致死性疾病，其病理特征主要表现为由中性粒细胞响应病原体相互作用而引起的广泛的炎症性肺损伤，肺炎和败血症是该疾病的主要病因。在耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和铜绿假单球菌引起的急性肺损伤小鼠模型中，使用DNase Ⅰ 干预或部分敲减PAD4(PAD4+/-)可部分降低NETs并提高小鼠生存率，然而完全敲除PAD4-/-虽然可以完全抑制NETs减轻肺损伤但也会加剧细菌感染的程度而加重炎症[48]。

囊性肺纤维化是以中性粒细胞持续流入受炎关节以及NETs持续释放为病理特征的慢性呼吸道疾病。在囊性肺纤维化的发病过程中，中性粒细胞和NETs通多堵塞气道而导致肺功能降低。肺部的慢性感染是由富含DNA和中性粒细胞蛋白的痰液引起的，而痰液中的DNA和中性粒细胞蛋白则被认为是由NETs释放[47]。在囊性肺纤维化患者中确实发现有持续的NETs产生，且NETs的产生量与炎症和疾病的严重程度成正相关。铜绿假单球菌是引起囊性肺纤维化的病原体，但现有的研究已证明临床分离的铜绿假单球菌菌株对NETs介导的杀生具有抗性，而且NETs的存在会促进肺纤维化区域的产生，还会刺激巨噬细胞从而导致持续的炎症反应。DNase Ⅰ 可以溶解囊性肺纤维化患者的痰液并改善囊性肺纤维化小鼠的肺功能[49]。

在2019年新型冠状病毒疾病(COVID-19)中，NETs与炎症的传播、微血管血栓形成和后期的急性呼吸窘迫综合征相关。在COVID-19患者的血清中，可以检测到胞外DNA、MPO和Cit-H3等NETs的特征性标记表达的升高，且与轻症患者相比，发生呼吸窘迫的重症患者的胞外DNA和MPO的水平更高，更重要的是COVID-19患者的血清可以在体外诱导NETs的生成[50]。另外NETs的形成还与ARDS、血栓形成、动脉粥样硬化等多种疾病的发病相关，这可能与COVID-19重症患者中出现的呼吸窘迫或血栓过多等症状相关，因此靶向NETs可能是治疗呼吸窘迫的重症患者以及降低死亡率的潜在靶点[51]。

2.3 NETs与晶体诱导的炎症性疾病 痛风是一种急性炎性关节炎疾病，由针状的尿酸钠晶体(MSU)在关节部位累积引起，晶体沉积在关节或肾脏进而引发炎症反应。中性粒细胞在痛风急性炎症发作的进展和消退中的作用尚未明确。在痛风的病理过程中，关节部位的免疫细胞被MSU激活后募集中性粒细胞至受炎关节部位。被募集的中性粒细胞响应MSU晶体，从而发生NETosis并释放炎性因子。关于NETs在痛风中的作用目前还不清楚，有研究认为NETs大量聚集产生的aggNETs在急性痛风性关节炎的炎症消退阶段发挥着关键性的作用[52]。但也有报道显示中性粒细胞耗竭并不影响急性痛风性关节炎的消退，相反在没有中性粒细胞的情况下，急性炎症期的炎症被明显抑制[53]，提示中性粒细胞释放的NETs在急性痛风性关节炎的炎症发作阶段是有害的，但其在辅助炎症消退方面的作用还需要等待进一步确证。

青少年皮肌炎(JDM)是罕见的血管病变，一般在儿童时期患病并伴有成年后心血管早衰的严重不良后果，在JDM的发病过程中会发生钙化现象，在软组织中形成钙晶体，值得注意的是，钙晶体多出现在发生皮肤炎症的儿童中，表明钙晶体与炎症之间存在紧密关联。最新的研究显示，从JDM患者体内分离的钙晶体能够在体外诱导NETs的形成，且与健康及未发生钙化的JDM患儿相比，发生了钙化的JDM患儿的组织及外周血中NETs水平明显升高，更重要的是靶向PI3K和NADPH氧化酶可以通过抑制NETs减少组织钙化的频率并预防动脉粥样硬化等并发症的发生[54]。

2.4 NETs与自身免疫性疾病 中性粒细胞NETs在自身免疫性疾病中也起着关键性作用。自身免疫性疾病是由于免疫系统对自身抗原不耐受而引起的炎性疾病。NETs通过将细胞内源性成分暴露于免疫系统参与自身免疫性疾病，且在炎症的起始阶段发挥着重要的作用，甚至可能导致自身抗体的产生。在系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)患者的血清和滑液中NETs的水平都有明显的升高[55-56]。因此，SLE患者的血清中有高浓度的抗核糖核蛋白和抗DNA抗体，而RA患者血清中则含有抗瓜氨酸化蛋白的抗体,且DNase Ⅰ缺陷型的小鼠会出现狼疮样症状。但NETs在SLE中的作用非常复杂，有研究显示，阻断线粒体的ROS产生可以在狼疮小鼠模型中阻断NETs并降低疾病的严重程度，但NADPH氧化酶缺失却会加重疾病。另一项研究解释了这一现象，系统性红斑狼疮中的NETs是由NADPH氧化酶非依赖性的途径介导的，但目前尚不清楚NETs是否可以作为SLE的治疗靶点[57]。

原发性抗磷脂综合征(APS)是一种自身免疫性疾病，主要表现为抗磷脂抗体(aPLs)的持续升高，使得个体易于发生动、静脉血栓或妊娠并发症。NETs与血小板激活和血栓形成之间的关系已被广泛报道，其在APS血栓形成中的作用也已得到确证，aPLs能够在体外诱导中性粒细胞NETs的释放，而从APS患者外周血中分离得到的中性粒细胞也更容易发生NETosis[58]。使用双嘧达莫治疗也能通过抑制NETs的形成而抑制aPLs诱导的小鼠血栓[59]。

2.5 NETs与其他炎症性疾病 急性胰腺炎是由于胰酶在胰腺内被异常激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的急性炎症反应。重症的急性胰腺炎会导致胰腺出血、继发感染、肺部炎症和休克，致死率高。有报道显示，L-精氨酸和胆碱缺陷型乙硫氨酸补充(CDE)饮食模型中，可以观察到胰腺组织中有NETs的形成，而在PAD4-/-小鼠中小鼠胰腺炎的严重程度有所降低，且小鼠生存率有所提高[60]。而向腺泡中注射NETs和组蛋白可诱导胰蛋白酶的形成，表明在急性胰腺炎的发病过程中，NETs不仅能够增加急性胰腺炎的炎症程度还可能直接参与了AP的病理生理过程，但其诱导胰蛋白酶形成的机制尚不清楚[61]。

3 NETs的治疗

3.1 DNase Ⅰ DNase Ⅰ 是最常用的NETs的抑制剂，是NETs的内源性降解酶，通过降解NETs的DNA骨架降解NETs，已被证明可以改善多种由NETs引起的病理反应。DNase Ⅰ的优点是该药物在临床上正在使用，DNase Ⅰ在临床上主要用于支气管扩张、肺脓肿、囊性肺纤维化等浓痰引起的炎症性疾病[62]，且没有表现出明显的毒副作用。然而DNase Ⅰ虽然能在狼疮小鼠模型中降解NETs，降低疾病的严重程度，但临床上将重组DNase Ⅰ用于SLE患者的治疗，患者血清标志物及其疾病情况却无明显的变化。此外，DNase Ⅰ只能分解DNA骨架而不能降解随NETs释放的组蛋白、弹性蛋白等颗粒蛋白，但这些蛋白却是NETs中重要的毒性因子[38]。

3.2 关键分子的抑制剂 研究过程中经常通过运用一些分子的抑制剂或敲基因动物来达到抑制NETs形成的目的，这些分子都可以作为NETs的治疗靶标。NE的抑制剂是目前研究最充分的抑制剂，目前NE的抑制剂塞来司他已在日本和韩国被批准用于ARDS的治疗，但在临床试验中它并没有增加ARDS的存活率，而最新的研究表明，用纳米颗粒系统递送塞来司他可以提高其在体内的利用率，从而提高塞来司他的成药性[63]。ROS的抑制剂(N-乙酰半胱氨酸)可以改善SLE患者的预后，而在狼疮小鼠模型中线粒体ROS的特异性清除剂可以降低疾病的严重程度并抑制NETs的产生[64]。但是，通过靶向NADPH氧化酶抑制剂干预RA和SLE小鼠模型中NETs的生成，则会导致刚严重的病理情况。NADPH氧化酶缺陷的患者也有更高的患自身免疫性疾病的风险。PAD4也是NETs形成过程中的关键分子，它可以在不影响氧化爆发的情况下抑制NETs生成，研究表明PAD抑制剂(例如：Cl-am或BB-Cl-am)能够在小鼠狼疮模型、小鼠炎性关节炎模型和小鼠糖尿病模型中抑制NETs生成并延迟疾病[65]。另外，MPO的抑制剂PF1355可以在小鼠的血管炎模型中抑制NETs的产生[66]。然而这些酶往往是维持正常生理活动所必需的，如果想在临床上运用其抑制剂来抑制NETs治疗相关疾病，必然要求药物有极高的选择性，否则会引起严重的副作用。而NETs本身也是机体的一种重要的抗菌防御机制，在抵御真菌等大型病原体上发挥着重要的作用，以NETs为靶点进行疾病治疗本身就存在导致严重的感染或慢性肉芽肿样症状的风险。

3.3 影响NETs生成的已上市药物 一些已上市的药物已被证明可能是通过抑制NETs来发挥其作用的，雷帕霉素是大环内酯类的mTOR特异性抑制剂，在临床上主要通过抑制T淋巴细胞的作用来达到免疫抑制的目的，最新研究发现它还可以通过抑制mTOR减少缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达进而抑制中性粒细胞NETs的生成，而这也可能是其实现免疫抑制的途径之一[27]。塞来司他是一种小分子的NE抑制剂，能够在体外抑制NETs的形成，在体内用塞来司他也能有效抑制LPS引起的小鼠肺损伤[63]。双嘧达莫是一种用于扩张冠脉血管、抗血栓形成的药物，可以通过增加胞外腺苷浓度和干扰胞内cAMP的分解来增强腺苷介导的信号转导通路。而胞内cAMP含量的升高能够通过抑制NADPH氧化酶的活性减少ROS，从而抑制中性粒细胞NETs的生成。最新的研究发现，双嘧达莫可以通过升高胞内cAMP的含量，抑制中性粒细胞NETs的产生，从而达到抗血栓的作用[59]，这些发现为以NETs为靶点开发新的药物提供了新的希望。

4 小结与展望

NETs作为中性粒细胞重要的免疫手段之一，在许多真菌等大型病原体介导感染性疾病中发挥着重要的抗菌作用，但是当它的抑制机制失调或被过度激活时，它也可能会介导疾病的病理过程。NETs的病理作用主要表现在炎症性疾病中导致宿主损伤或在自身免疫性疾病中导致适应性耐受性的下降。现在，以NETs为靶点的药物研究还比较少，主要是因为考虑到NETs本身潜在的有益的抗菌功能，如果对其进行全身性的抑制，可能会出现严重感染或慢性肉芽肿样症状等副作用，因此在以NETs为靶点进行药物研究时一定要高度重视对其靶向性和特异性的考察。但关于雷帕霉素和双嘧达莫的报道为以NETs为靶点进行药物研究和临床治疗提供了可能。通过进一步的研究了解NETs的调控、功能和病理作用，最终实现在不干扰其免疫作用的前提下抑制其损伤属性并用于指导临床治疗和药物研究。