GSDMD介导的细胞焦亡研究进展

叶淑敏，胡庆华

(中国药科大学药学院，江苏 南京 211198)

2001年，一种不同于细胞凋亡的细胞死亡方式被发现，然后被定义为细胞焦亡[1]，2015年发现gasdermin D(GSDMD)作为细胞焦亡的下游蛋白发挥着重要作用[2]。炎症小体激活后，切割半胱天冬氨酸(caspase-1/4/5/11)，切割后的成熟半胱天冬氨酸作用于GSDMD，形成的GSDMD-N端通过寡聚化会在细胞膜上形成孔洞，产生水分内流、细胞膜内外离子梯度消失，细胞发生肿胀、渗透性溶解最终导致破裂死亡。通过对细胞焦亡的形态特征、分子机制及其与相关疾病的深入研究，将有助于为相关疾病的诊疗提供新的防治策略。本文就近年来细胞焦亡的发生机制及其与相关疾病的关系进行研究与讨论。

1 细胞焦亡与GSDMD之间的关系

细胞焦亡是近些年来的热门研究之一，它是一种不同于细胞凋亡的细胞程序性死亡方式。细胞凋亡时的特征是细胞自主分解的程序化过程，不会将细胞的内容物释放到细胞外，通常伴随着细胞核固缩、核凝聚和核碎裂，及形成凋亡小体后被体内的吞噬细胞所吞噬[3]。然而细胞焦亡却是一种不同于细胞凋亡的程序性死亡方式，它能引起细胞质膜迅速破裂，将细胞内容物释放出去，包括一些促炎因子IL-1β、IL-18等[4]。

2015年，两个不同的研究组将GSDMD确定为炎症性半胱氨酸酶的直接靶标。Shi等[2]利用CRISPR-CAS9方法筛选出TLR4-/-骨髓巨噬细胞(BMDMs)依赖caspase-1的细胞焦亡和依赖caspase-11的细胞焦亡的基因，而Kayagaki等[5]建立了一个正向遗传筛选，通过筛选可以耐受LPS诱导的乙基-N-亚硝基脲(ENU)突变小鼠的细胞焦亡的基因。这两个组均确定了一个名为GSDMD的基因。同时，另一个研究组通过质谱发现，GSDMD为尼日利亚菌素诱导的NLRP3炎症小体的关键成分[6]。

细胞焦亡的形态学特征是在细胞膜上形成孔洞，细胞膜失去完整性，膜的屏障功能消失，导致细胞发生溶胀破裂，但是细胞核依然保持完整。进一步研究表明，GSDMD与细胞膜上孔洞的生成有密切关系。GSDMD作为一个二联蛋白，它包含一个30 kDa的N端结构域(GSDMD-N)和一个20 kDa的C端结构域(GSDMD-C)，该结构域包含保守序列“(F/L)L(S/T)D”，可被半胱氨酸蛋白酶识别[2,5-7]。识别并切割后，GSDMD-N端易位到质膜上，在负染色电子显微镜下，GSDMD-N端寡聚化后形成的膜孔内径约为10～15 nm，孔的宽度足以允许成熟的IL-1β和IL-18通过[8]。当细胞膜上出现许多的膜孔之后，细胞膜的渗透压出现失衡，质膜破裂，最终导致焦亡的发生[9-10]。GSDMD-N端能特异性识别酸性脂质，例如：磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酸(PA)和磷脂酰丝氨酸(PS)，GSDMD-NT与细胞膜相互作用，构成内部膜双层的小叶[11-12]。研究显示，GSDMD-N端也能结合一种特殊的脂质—心磷脂，这种脂质存在于细菌的质膜及线粒体内膜上，并且在体外实验中，重组的GSDMD-NT显示出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌强大的杀灭能力，表明GSDMD在介导直接细菌杀伤免疫防御中具有潜在作用[8]。

2 细胞焦亡发生的分子机制

作为一个新的程序性死亡方式，细胞焦亡发生分为依赖caspase-1的经典途径和依赖caspase-11、caspase-4/5的非经典途径。细胞焦亡不仅在抗微生物感染中发挥作用，也与非病原性感染有一定关系，深入研究细胞焦亡有助于找到疾病新的治疗靶标。

2.1 经典途径 病原体微生物刺激人体后，细胞内模式识别受体(PRR)诱导寡聚，它们与凋亡相关的微粒蛋白和半胱天冬酶前体组装在一起，形成炎症复合物，该复合物可以识别病原相关分子模式(PAMPs)，例如：细菌、真菌、病毒等，而损伤相关分子模式(DAMPs)，例如：ATP和胆固醇，可以促进免疫细胞(巨噬细胞、树突状细胞)分泌IL-1β和IL-18，引起细胞焦亡[13]。在经典途径中，细胞内PRR接收信号刺激，炎症体开始组装，形成的炎症小体可以激活caspase-1前体，形成活性caspase-1。而活性caspase-1一方面能促进IL-1β和IL-18前体裂解，形成成熟的IL-1β和IL-18，另一方面也可以切割GSDMD形成GSDMD-N端和GSDMD-C端，GSDMD-N端能与真核细胞上的磷脂酰肌醇磷酸酯结合，形成孔洞后，细胞内部和外部的渗透压失衡，导致细胞裂解死亡，同时成熟的IL-1β和IL-18释放到细胞外，募集免疫细胞引发炎症反应，最终形成细胞焦亡[14]。Caspase-1介导的细胞焦亡经典途径是先天免疫中重要环节。

2.2 非经典途径 小鼠caspase-11和人caspase-4/5可以诱导非经典细胞焦亡途径。Caspase-11可以直接识别并结合LPS，作用于GSDMD并切割产生GSDMD-N端，促进细胞焦亡的发生[15-16]。Caspase-11还能激活pannexin-1通路，释放ATP，促进膜通道P2X7的开放，诱导细胞焦亡的发生[17]。Caspase-11也能激活NLRP3和下游caspase-1，导致炎症因子的释放。Caspase-11/4/5非经典途径可以通过控制GSDMD形成的孔洞调节钾离子的释放，从而与NLRP3-ASC-caspase-1途径产生联系，间接调控IL-1β和IL-18的释放[5]。这种调控方式提示了经典途径与非经典途径之间能够通过NLRP3炎症小体来相互作用，相互转化。

3 GSDMD抑制剂

Necrosulfonamide (NSA)是一种小分子化合物，它在体内和体外实验中能直接抑制细胞焦亡所造成的膜孔的形成，及由吡啶、NLRP3和NLRC4炎症小体导致的IL-1β的释放。深入研究后发现，NSA能与GSDMD结合，抑制GSDMD-N端的寡聚，导致无法形成细胞膜孔从而阻止细胞出现细胞焦亡。NSA不会抑制GSDMD的二聚化，而是抑制二聚体的组装。体外实验表明，NSA以32 μmol·L-1的结合亲和力结合在GSDMD蛋白上，在抑制炎症体下游细胞焦亡发生的同时，保持其他通路例如TLR4信号转导和GSDME介导的细胞死亡通路的完整性[18]。NSA作为一种小分子抑制剂，可以作为荧光探针更好地测量体外难以测定的GSDMD形成的膜孔，不仅对细胞焦亡的研究有着重要的意义，而且可以作为GSDMD介导的各种炎症性疾病包括炎症性肠病、炎症性关节炎和败血症的靶标，为未来炎症性疗法的发展提供依据[18-19]。

4 GSDMD介导的细胞焦亡与疾病的关系

4.1 神经炎症 中枢神经系统中，作为先天性免疫细胞的小胶质细胞参与细胞焦亡引发的炎症反应。神经炎症在急性创伤性脊髓损伤(SCI)的继发性损伤中起关键作用，因此控制小胶质细胞的活化及炎症反应时产生的炎症因子可能会帮助SCI的治疗[20]。在Dai等[21]的研究中发现，南藤蛇醇(celastrol)抑制SCI大鼠中焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD的表达，减少TNF-α、IL-1β、IL-8的释放，同时抑制小胶质细胞焦亡的发生，减少小胶质细胞的活化和炎症因子的释放，从而减少脊髓损伤后的空腔区和神经元的丢失，减轻炎症反应，促进大鼠神经功能的恢复。

4.2 肝脏缺血再灌注后的神经系统并发症 肝脏缺血再灌注(HIRI)是许多肝脏手术中的重要的病理生理过程，它能引起炎症因子、趋化因子及ROS的释放，引起炎症和氧化应激反应，并导致细胞死亡。有研究显示，HIRI后神经系统并发症的发生率约为20%，所以HIRI与神经系统并发症之间可能存在一定联系[22-23]。Zhang等[24-25]的研究显示，NLRP3、caspase-1、ASC及GSDMD的表达在HIRI发生6 h后达到峰值，降低后在第三天又出现峰值，由此推测，HIRI产生的ROS可能激活海马和皮质层的NLRP3炎症小体导致炎症的产生并出现神经元损伤。最近的研究表明N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体亚基2A(NR2A)通过Src-PSD95-NR2A途径在HIRI引起的海马损伤和认知障碍中发挥了关键作用，通过使用NLRP3选择性抑制剂MCC590，可以在一定程度上改善HIRI引起的神经元NLRP3表达水平升高和焦亡的发生。

4.3 肾损伤 急性肾损伤(AKI)作为一种严重的临床并发症，会导致肾功能快速下降和高临床死亡率，其中肾小管细胞死亡是作为一种重要的组织病理学标志[25-26]。Caspase-11在肾小管上皮细胞发生损伤时出现上调，能在顺铂或者是缺血再灌注造成的AKI所引起的GSDMD的切割中发挥作用。Caspase-11基因敲除小鼠中，用顺铂处理的小鼠明显肾损伤减弱，肾小管的损害减少，并且IL-18的释放减少。同时，在caspase-11下游底物GSDMD基因敲除小鼠中也能发现顺铂诱导的肾脏形态和功能的恶化得到一定程度的缓解，也能明显抑制IL-18的释放，从而调节中性粒细胞和巨噬细胞浸润，达到缓解AKI的作用[27]。

4.4 动脉粥样硬化 高脂饮食会导致血管壁中脂质的积累促进动脉粥样硬化的发生，继而导致炎症、动脉结构改变和细胞死亡，而血管平滑肌细胞(VSMC)中的细胞死亡，可引发斑块形成并加剧动脉粥样硬化发展[28-29]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是动脉粥样硬化的主要危险因素，Pan等[30]在VSMC中，发现ox-LDL能促进AIM2和GSDMD-NT的表达。进一步研究发现，AIM2过表达能增加ApoE基因敲除小鼠的GSDMD活性和DNA片段化。体外实验中，AIM2表达的增加加速了细胞焦亡的发生，而在VSMC中抑制AIM2的表达可以减少细胞焦亡，并且AIM2可以通过VSMC中的ASC，capase-1途径促进GSDMD-NT的表达。

4.5 糖尿病肾病 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症，特征是肾小管基底膜和肾小球膜增厚，肾小球细胞增殖和细胞外基质积聚[31-32]。研究显示，炎症发生导致的巨噬细胞的浸润与DKD的发病有一定的关系，NLRP3/caspase-1/IL-1β途径的激活发生在DKD的早期。Wang等[33]在体内和体外高糖条件下发现，caspase-1、GSDMD、IL-1β的表达增加，抑制TLR4/NF-kB信号通路的传导可以逆转这种情况，说明TLR4/NF-kB信号转导参与了DN中肾小管细胞的细胞焦亡。

4.6 急性肺损伤 急性肺损伤(ALI)是脓毒症的常见并发症，特点是肺出现不可控制的炎症反应。虽然在ALI在近期取得很大进展，但是依旧没有有效药物能治疗ALI[34]。据报道，二氢杨梅素(DHM)能够抑制血管内皮细胞的NLRP3炎症小体的活化来发挥抗炎作用。Wang等[35]的研究显示DHM能治疗CLP引起的严重肺损伤，治疗显著降低了CLP诱导的肺组织病理损伤，炎性细胞浸润，总细胞和中性粒细胞数以及总和蛋白质和白蛋白浓度，减轻NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β，同时也能减少GSDMD和GSDMD-N端的生成，在CLP诱导的ALI中起保护作用。有研究显示，Ac-YVAD-CMK，一种特定的caspase-1抑制剂，可以预防肺泡巨噬细胞焦亡产生的损伤。根据这些研究显示，抑制NLRP3炎症小体的激活及下游细胞焦亡的发生，能够改善ALI。

4.7 肿瘤 GSDMD在胃癌细胞系和模型中表达降低，进一步研究发现，GSDMD降低后通过激活细胞周期相关蛋白STAT3和PI3K/PKB通路的表达，加速S/G2相的转变，促进肿瘤细胞生长。并且与正常裸鼠相比，GSDMD表达降低的细胞在植入胃癌细胞后肿瘤体积更大，说明GSDMD的表达水平与胃癌的发生有关[36]。

细胞凋亡是癌症发生的主要原因之一，逃避细胞凋亡是化学和放射性疗法的促成原因。激活非凋亡的程序性细胞死亡(PCD)可能是抗凋亡性癌症的有效替代疗法。食管鳞状细胞癌(ESCC)患者有较高水平的PELP1表达，研究显示，PELP1参与细胞凋亡和细胞自噬的调控。二甲双胍在最近的研究中表明其有抗癌作用，它能通过靶向miR497/PELP1通路诱导ESCC发生GSDMD介导的细胞焦亡，减少细胞凋亡的发生[37]。

肿瘤的发生与多种因素有关，包括原癌基因和抗癌基因的活性，免疫微环境，氧化应激反应和慢性炎症。组织或细胞长期暴露于炎症环境会增加患癌的风险。一方面，肿瘤细胞焦亡意味着肿瘤细胞的生长受到抑制从而显示出抗肿瘤活性，炎症小体的产生能抑制某些肿瘤的发生。另一方面，在细胞焦亡过程中炎性因子的释放会激活促细胞周期激酶，形成肿瘤生长微环境，促进肿瘤生长。综上，GSDMD介导的细胞焦亡的发生在肿瘤中的存在还需要进一步的研究。

5 展望

随着细胞焦亡基础研究的不断深入，人们对细胞焦亡的发生、发展有了更多的了解。而GSDMD作为一个新发现的蛋白，对其功能、结构的探究促进靶向药物的开发，从而能够治疗多种与细胞焦亡相关的疾病。目前针对细胞焦亡的药物还在探索阶段，靶向细胞焦亡的研究不仅对相关方向新药设计和开发有积极作用，还能进一步探索细胞焦亡与多种疾病之间更深层次的联系。但是不仅仅是GSDMD，还有GSDM家族其他蛋白也参与细胞焦亡，对于它们与细胞焦亡之间的关系以及细胞焦亡与多种细胞死亡方式之间的转化与平衡，还需要更深入的研究。