改良凯氏定氮法的研究进展

卢锦斌,张利敏,徐秀容*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨凌712100；2.陕西华秦农牧科技有限公司,陕西 杨凌712100)

蛋白质是维持畜禽健康和生命活动的物质基础。畜禽的蛋白质来源是饲料，因此饲料中蛋白质含量的测定是生产的关键环节之一。而蛋白质的测定方法有很多，有传承一百多年的经典方法，也有快速高效的新方法，但这些方法都存在一定的局限性和适用范围。那么，不同规模的饲料、食品生产企业或实验室所用的方法是否一致？经典的凯氏定氮法为何至今仍被广泛应用？对经典方法中存在的主要间题即耗时过长如何改进？本文拟对凯氏定氮法的改良研究进行综合论述，以期回答当代凯氏定氮法的应用价值，并且对如何更快速准确测定蛋白质含量提出讨论和建议。

1 蛋白质含量测定方法

1.1 分类

蛋白质含量测定方法根据原理可分为间接测定法和直接测定法[1]。间接法包括凯氏定氮法、杜马斯燃烧法等，是先测出样品的含氮量再换算出蛋白质含量；直接法是依据蛋白质的理化性质直接测出样品的蛋白质含量，如超声波法、分光光度法及近红外光谱法等。其中，凯氏定氮法被国际公认为测定蛋白质含量的标准方法。

1.2 优缺点比较

凯氏定氮法之外的其他方法都各具优点，甚至在缩短检测时间、提高检测准确度、节约能源、减少污染及实现生产上的实时检测等方面领先于凯氏定氮法，但都因存在较大的不足之处而未能广泛应用。如：杜马斯燃烧法的前处理简单，可自动加样，大大节省检测时间和人力成本，而且在封闭的环境中进行，不会造成环境污染，是理想的蛋白质测定方法，但由于其对反应条件的要求较高、仪器较贵且不易维修等原因，不适用于小规模企业或实验室；分光光度法操作简便、测定快速、准确度高，但一般只适用于检测可溶性蛋白且对于溶液环境要求高，灵敏度易受干扰，所以不太适用于实际生产；近红外光谱分析技术是无损检测技术的一种，具有无损、快速、准确的优点，可实现在线实时检测，可检测饲料样品中的大多数成分，具有广泛的应用前景，但需要提前建立足够大的样品数据库，这是一个冗杂的工作，而且近红外仪器价格昂贵，现阶段对于大多数企业来说尚不适用。

1.3 凯氏定氮法

目前中国饲料中粗蛋白的测定标准(GB/T6432-2018)采用的便是凯氏定氮法，其原理是：样品在浓硫酸中加热消煮，在催化剂的作用下分解出氨气与硫酸结合生成硫酸铵，再通过碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以酸标准溶液滴定，通过消耗的酸的体积即可计算该样品的蛋白质含量[2]。

凯氏定氮法虽然准确，但耗时长，对样品的消煮至少需要3 h，导致工作效率不高。并且其测定结果易受干扰，如消化时间短、消煮温度较低或过高、蒸馏时间过短等，都会影响准确度。而样品粉碎度、装置封闭性等也影响结果[3-4]。此外，样品在全过程中进行的重复性试验也可能产生差异[5]。为解决这些问题，一直以来人们都在对凯氏定氮法进行改良。

2 国内外改良研究概况

对于凯氏定氮法的改良，围绕消煮、蒸馏及滴定3个环节进行。

2.1 消煮环节

凯氏定氮法耗时最长的环节就是消煮过程，一般至少需要3 h，有时长达6 h。消煮不仅耗时，而且消耗大量电能。因此，对消煮环节进行改良，既可以缩短时间也可以节约能源。消煮环节的改良从催化剂和消化液两个方面入手。传统凯氏定氮法催化剂为CuSO4·5H2O与K2SO4(1∶15)混合催化剂，即0.4 g CuSO4·5H2O与6 g K2SO4混匀，搭配12 mL H2SO4消化液。也有一些研究人员使用3.4 g混合催化剂搭配10 mL消化液。

2.1.1 催化剂

2.1.1.1 硒 传统的凯氏定氮法大量使用混合催化剂和浓硫酸易造成环境污染。硒(Se)是常见的化学催化剂，具有价格低、反应温和、对环境污染小等优点。自19世纪30年代以来，Se就开始被用作凯氏定氮法中的催化剂，此后几十年有关报道不断[6-9]。Ashton[10]使用0.2 g的Se作为催化剂，用凯氏定氮法分别测定土壤和草中的蛋白含量，发现当草中转化出的含氮量相同时，Se的催化时间比CuSO4节省90 min左右；而如果要把土壤中的氮全部转化成硫酸铵，用Se催化最快只需3 h，而用CuSO4催化则需要24 h，结果表明以Se作为催化剂的反应时间优于CuSO4作为催化剂的时间。Bremner[11]在综述前人研究的基础上对比了使用硒、汞、铜3种催化剂的凯氏定氮法测定土壤中蛋白含量的差异，发现3种催化剂的催化效率排序为硒>汞>铜。

陆晓滨等[12]试验表明使用硒粉作为催化剂的最佳用量为0.15～0.20 g，并且对比了分别用硒粉和硫酸铜作催化剂对样品的消煮效果，结果表明当达到同样催化效率时，硒粉组用时30 min，硫酸铜组用时80 min，说明硒粉可大大提高催化效率。李萍等[13]以硒粉替代CuSO4作为催化剂测定污泥中的蛋白含量，确定了硒粉的最佳添加量为0.15 g，该条件下，当污泥中的氮素完全转化为NH4+时，硒粉催化用时1 h，CuSO4用时1.5 h，表明该法与传统凯氏定氮法相比时间缩短，且结果误差小、稳定可靠。在生产中，硒粉与K2SO4被按照一定的比例制成定氮催化片，使用更为方便。

2.1.1.2 过氧化氢 H2SO4与混合催化剂组合法消化效果好, 但在反应时容易产生大量泡沫，造成反应不均匀或氮素随着泡沫溢出而损失，若不能消除泡沫，则无法实现快速分解。在食品检验中常用H2O2消泡，而适当加大H2O2的量可促使样品快速分解，该方法称之为双氧水测定法。Bowman等[14]向100 mg植物组织中加入3 mL H2O2置于100 ℃预处理15 min，发现加入H2O2不仅起到消泡作用，还使植物中的NO3-N减少到最小，测定的准确性提高了，整个消煮过程也只用了1 h左右。苗雪原[15]采用H2O2-H2SO4-混合催化剂法对粗蛋白含量为30.4%的鱼用配合饲料进行测定，将混合催化剂和H2SO4用量分别减少到3.5 g和10 mL，试样仍可以快速分解，且消化总时间为0.5 h，检验结果不仅与原法高度一致，且准确度与精密度都优于国标要求。

H2O2-H2SO4-混合催化剂法是利用H2O2部分替代混合催化剂进行反应，在实践中该方法进一步得到改良，采用H2O2完全替代混合催化剂的方案不仅有效而且节省试剂。赵德志等[16]用H2O2替代国标法中的混合催化剂对鱼粉和棉粕进行测定，不经过消化炉消煮即可分解样品，试验结果与国标法的比值稳定在1.715左右，误差仅为0.041%，符合国标法规定的<1%。而采用该方法测定不同产地的同种样品，所测值的波动性较小，稳定性较好。

2.1.1.3 氯化钡 强碱直接蒸馏法(Direct Distillation，俗称DD法)是间接测定饲料蛋白含量的一种简便方法，其与传统凯氏定氮法最大区别在于将样品在强碱溶液中消化，使其快速分解，一般采用的是氯化钡溶液。李秀玲等[17]向装有1 g甘薯试样的凯式瓶中加15 mL10%氯化钡溶液，再加40～50 mL 45%氢氧化钠溶液，立即连接蒸馏装置，后续操作与国标法无异。试验测得的不稳定氮量与国标法测得全氮量之间存在回归方程：y=0.6934x+0.2576，相关系数r=0.9840。王潍波[18]用该法测鱼粉、玉米蛋白粉和豆粕的蛋白含量，结果与国标法相差不大，标准差在允许范围之内，证明该方法与国标法具有相同准确度。

2.1.2 消化液 对凯氏定氮法的改良，大部分是在催化剂方面，而消化液的报道较少。传统的H2SO4消化液适用于大多数样品，但有时候消化能力有限。据梁芳珍[19]考证，Betay于1974年利用H2SO4-HClO4混合消化液测定植物样品含氮量，能缩短消化时间，但用于无腺棉仁的效果不足。其在此体系基础之上，提出用H2SO4-HClO4-H2O2混合体系测定无腺棉仁蛋白含量，结果比标准值略低，但在误差范围内。

2.2 蒸馏环节

传统的凯氏定氮法用的是手动蒸馏装置，一般常用的是半微量蒸馏法。随着设备制造技术的发展，半自动凯氏定氮仪和全自动凯氏定氮仪相继问世，凯氏定氮法的自动化程度提高。

2.2.1 半自动定氮仪 半自动凯氏定氮仪是自动进行蒸馏过程的装置，样品消煮完后放入定氮仪中，关闭安全门，启动程序，机器即可自动对样品进行加试剂、蒸馏。半自动凯氏定氮仪的应用是对人力的一大解放，也使得测定的精确度大大提高。罗源[20]使用KDY-04(A)半自动定氮仪测定不同种类样品的蛋白含量，测定结果与凯氏定氮法相比无显著差异，精密度和准确度均理想。张晓影等[21]指出不同检测人员使用半自动定氮仪所测结果符合允许误差范围，满足试验要求。半自动定氮仪自动化程度高、精确度高且价格便宜，能满足大多数饲料生产企业的使用需求。但使用前后要进行空蒸，以清洗管道、降低误差[22]。

2.2.2 全自动定氮仪 全自动定氮仪的自动化程度比半自动定氮仪更高，不仅可以自动加试剂自动蒸馏，还可以自动滴定、自动计算。蒋江虹等[23]报道用FOSS2300型全自动定氮仪测定大豆样品结果与经典方法无显著差异，认为该法有效减少人为操作误差带来的影响，可作为优选方法推广使用。黄瑾等[24]用BuchiK-370全自动定氮仪测定不同浓度的饲料蛋白含量，准确度高，与半微量蒸馏法的最大相对偏差仅为0.51%，也说明了全自动定氮仪的使用价值。但全自动定氮仪较为昂贵，小规模企业或实验室可能不具备购置条件。

2.3 滴定环节

传统凯氏定氮法的滴定，是在试样的蒸馏分解液中加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，再用0.1 mol/L或0.02 mol/L的盐酸标准溶液进行滴定，当溶液由蓝色变为灰红色时为滴定终点，此时根据盐酸的消耗体积进行计算，从而得出数值。在前人的改良中，常见的是替换指示剂和标准溶液，也有采用酸度计标定的。

2.3.1 指示剂与标准溶液 凯氏定氮法的指示剂一般是甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，是甲基红0.1%乙醇溶液与溴甲酚绿0.5%乙醇溶液等体积混合而来，常见的还有用甲基红-次甲基蓝混合指示剂。Scanlan[25]在测定皮革和面筋中的氮含量时，选择苯甲酰胺作为指示剂，试验证明苯甲酰胺作为指示剂优于甲基红指示剂。赵德志[16]在使用双氧水测定法时，使用酚酞试剂作为新方法的指示剂，作为对照的传统方法依然用混合指示剂，但是其没有对此进行详细说明。

李维美等[26]测定样品蛋白含量，消煮、蒸馏步骤与传统凯氏定氮法一样，仅在滴定阶段利用碘酸氢钾标准溶液替代盐酸标准溶液，测定结果变异系数0.35%比传统方法要小，准确度高。

2.3.2 酸度计 酸度计又称作pH计，是测定溶液酸碱度的仪器，具有快速、精确的优点。贾丽艳等[27]在测定绿豆粉蛋白含量的滴定过程中，将酸度计法与混合指示剂法进行比较，发现两种方法测得的结果相近，准确度和精密度都符合要求。

3 小 结

凯氏定氮法作为测定蛋白含量的经典方法，在无损检测技术广泛应用的时代仍然具有应用价值和代表性。本文探讨了凯氏定氮法3个环节的改良问题，实际上关于凯氏定氮法改良的重点是关于消煮环节的改进，如何高效催化样品又不造成氮的损失是研究这一问题的关键。

研究人员对于凯氏定氮法的改良主要集中在缩短检测时间和提高准确度这两点，但不同改良方法对于不同样品所测结果可能不同。本文总结前人的研究，提出在凯氏定氮法改良领域尚待解决的一些问题：(1)是否存在一种对于不同饲料原料来说都适用且在缩短检测时间和提高准确度上面都具有优势的改良方案？(2)目前的改良法大多针对单个环节进行改良，而把不同环节改良法组合起来的改良方案是否更具有检测方面的优势？(3)不经过消化炉消煮即可分解样品的改良方案其准确性究竟如何，是否具有可行性？因此，凯氏定氮法的改良还可以进一步探讨。