鸡球虫抗原及疫苗的研究进展

樊明明，吕玉金，吴玉臣

（河南牧业经济学院，河南郑州450046）

鸡球虫病是一种原虫病，由艾美耳科艾美耳属的球虫寄生在鸡的肠道上皮细胞内引起，是养鸡业中十分常见且危害极严重的疾病之一。全球每年因球虫病带来的损失高达15～20亿美元[1]。其中，美国每年的经济损失为6.4亿美元[2]。而我国每年因此造成的经济损失达25亿元人民币[18]。在研制及球虫疫苗之前，应首先熟悉鸡球虫不同阶段抗原的免疫原性，才能将球虫的保护性抗原编码基因片段克隆到表达载体，进而研制出免疫效果显著的新型疫苗。

1 鸡球虫抗原的研究

1.1 无性生殖阶段抗原

1.1.1 微线蛋白

研究发现，微线蛋白约有20种，目前有5种被报道，RT-PCR分析显示，在孢子化6h后EtMIC-3、4、5出现，而在孢子化12h后EtMIC-1、2才能被检出。EtMIC-1是一种糖蛋白G相关蛋白，分子量10～11万，在巨型艾美耳球虫中发现了一种和Et-MICI-1相似的蛋白，与其有高度序列同源性。Et-MIC-2为分子量50ku的微线蛋白，研究表明[3]，其主要参与溶膜入侵过程。EtMIC-3主要对子孢子入侵培养细胞有抑制作用。EtMIC-4的分子量为21.8万，其免疫原性有待进一步研究。目前关于EtMIC-5免疫原性相关报道还未见到，据推测其编码蛋白约100ku大小。此外，Tomley克隆了EtMICI(Et100)，其与禽类各种球虫的同源性都很高，且有与灰色血栓形成蛋白、备解素等相似的基因序列，说明其既与入侵有关，还可能和裂殖子的运动及逸出相关。

1.1.2 折光体蛋白

球虫在子孢子阶段和第一代裂殖体阶段均含有折光体，SO7是被报道较早的一种折光体蛋白，其分子质量为26ku。CheY.SO7是一种重组抗原，其分子质量为36ku。研究发现，其在构型上表现为天然抗原的B细胞表位存在缺失或部分缺失，这也直接导致了其免疫原性主要来自细胞免疫。此外，重组抗原CheY.SO7能够诱发抗多种球虫感染的交叉保护反应[4～5]，这一结果通过用兔抗CheY.SO7血清免疫7种主要鸡球虫的孢子化卵囊得到了充分的证实，因为它们都含有相应的免疫优势多肽。

1.1.3 热休克蛋白

热休克蛋白存在于细胞质内或线粒体内，能够参与蛋白质的生物合成、折叠和分泌，同时还可以与新生成的尚未折叠的前体蛋白相粘附，促进相应蛋白质在基质中的移动和折叠。Hsp的分子量为7万，是E.maxima子孢子阶段的抗原，免疫原性良好，能够显著刺激E.maxima感染鸡T淋巴细胞的增殖，是宿主抗体和T淋巴细胞的靶目标。EaHsp也是E.acervulina的热休克蛋白之一，与Hsp70具有一定的同源性。

1.1.4 表面抗原

有子孢子表面抗原和裂殖子表面抗原。子孢子表面抗原目前已知的有Wisher等鉴定的125I标记的表面抗原和35S-蛋氨酸标记和未标记的细胞浆和内膜成分，主要抗原成分有32～45个，分子质量9～33ku不等，其中15%的抗原具有免疫原性。TA4是E.tenella子孢子的表面糖蛋白，其生成过程起始于乱囊开始孢子化的16～20h，可能与虫体侵入宿主细胞有关。xMzp5-7是E.tenella是一种表面蛋白，分子量为33ku，主要作用是能够激活球虫感染期的免疫应答反应，不仅可以诱导宿主产生抗体，还可以被宿主自然感染后恢复期的血清识别，3-1E是E.acervulina的表面抗原，由170个氨基酸组成，在子孢子与裂殖子生殖阶段都存在，长度1086 bp，有一个阅读框；重组的3-1E蛋白也可以介导细胞免疫，促进脾细胞增殖以及诱导IFN-γλ的生成。

1.2 有性生殖阶段抗原

有性生殖阶段抗原包括未孢子化卵囊抗原、配子体和合子。GAM56、GAM82和GAM230是分子质量分别为56ku、82ku和230ku的E.maxima配子体特异性蛋白。它们能够抑制E.maxima的发育，也可以诱导宿主产生免疫反应。其中GAM56和GAM82还参与卵囊壁的形成，但是只在大配子表达。

1.3 新发现抗原

1.3.1 乳酸脱氢酶

乳酸脱氢酶（LDH）是E.acervulina蛋白，分子质量为37ku，也可同时在E.tenella和E.maxima表达，但这3种艾美耳球虫的LDH相似性只有66%～80%，表明其具有遗传多样性。LDH是只能在细胞内合成的一种蛋白，该蛋白在球虫的卵囊、子孢子、裂殖体、裂殖子时期都有相似的表达。

1.3.2 EmTFP250

EmTFP250是E.maxima无性繁殖阶段的大分子蛋白，宿主免疫后，其后代会产生明显的对球虫保护作用。Wit combe等研究发现，EmTFP250和E.tenella的EMIC4有71%的同源性。并且至少有4种艾美耳球虫中都含有EmTFP250基因，这提示了该抗原潜在的交叉免疫作用。Western blotting检测发现，EmTFP250有很好的免疫原性。

2 球虫疫苗及其免疫效果

2.1 球虫活疫苗

球虫活疫苗能够替代抗球虫药物控制球虫病[6]。它的作用机理主要是通过低水平的感染，使鸡对再感染产生一定程度的抵抗力，进而产生保护性免疫力。

2.1.1 球虫活疫苗的分类

目前已报道的球虫活疫苗有强毒和弱毒卵囊苗[7]。目前报道使用的有Coccivac疫苗（美国）、nmucox疫苗（加拿大）以及离子载体类耐药菌株的强毒疫苗；而Paracox疫苗（英国）和Livacox疫苗（捷克）则属于弱毒苗。近年来，陆续有些学者尝试选育耐药的弱毒株[8]，在1995年，索勋等人首次提出球虫晚熟系概念，以期为球虫病免疫预防提供新虫系，为研究球虫生活史调节机制提供参考材料[9]。

2.1.2 球虫活疫苗的免疫效果

2.1.2.1 强毒苗的免疫效果。Edgar是一种强毒苗，内含8种鸡球虫的混合孢子化卵囊，主要通过饮水或拌料给4～10日龄鸡接种，这种混合孢子化卵囊也就是世界上最早的商品化的球虫疫苗。这种疫苗的接种方式为投服，投服时间上可以是每天、也可以是一次性，还可以按周投服但剂量上需要把握，不同的方式和剂量，所获得的免疫力效果也有差别，且不易把握，这也是强毒苗的主要缺点。

2.1.2.2 弱毒苗的免疫效果。随着发展，学者们开始研究致弱虫苗即弱毒活苗。通常由野外分离的强毒株进行致弱后的弱毒虫株研制而成，能保证良好的免疫原性，有降低了致病力，不会对肠道造成严重的损伤，但是制作过程较为繁琐。德国，英国，荷兰，意大利等地对早熟株免疫进行了田间试验，效果比强毒株令人满意；中熟株疫苗试验[10]结果表明：其免疫效果受温度、湿度的影响较大，6周龄的鸡免疫时，保持温度20℃～28℃，垫料湿度25%～30%时免疫效果良好，其球虫病死亡率为0.01%～0.34%，总死亡率也低于2.5%，免疫后不使用抗球虫药，到24周龄时，鸡的成活率达93%以上；晚熟株疫苗有较好的稳定性；混合株球虫疫苗滴服免疫效果更佳，基本上能够达到100%的保护效果，对小鸡的生长保护也也有一定的效果。

2.2 基因工程苗及其免疫效果

弱毒疫苗相对比较安全，但制作过程繁琐不易，而强毒疫苗在使用时存在有一定的风险，剂量难控制，对使用技术要求较高。随着现代生物技术的发展，利用基因重组技术将抗原蛋白的基因插入动物基因组中，可以构建基因工程疫苗，诱导机体产生免疫，从而获得抗原蛋白，可以克服传统疫苗制作繁琐和毒力不稳定等缺点。

以色列雅贝克公司从巨型艾美耳球虫的配子体中分离而得的亚单位疫苗CoxAbic，含有3种主要抗原，分子质量分别为230ku，82ku，56ku。其可以通过肌肉注射的方式，诱导机体产生抗体进入卵黄，进而孵化后对雏鸡的感染产生被动保护[12]。这也进一步说明如果配子(母)细胞抗原作为母源免疫在鸡球虫病控制中有价值，那么用以载体构建的裸DNA疫苗来免疫产蛋鸡将有重大的意义。

部分试验研究表明，以沙门杆菌作为表达载体的DNA疫苗能够诱导局部和全身体液免疫和细胞免疫应答[5]。杜爱芳等人[13]通过把重组质粒pcDNA3-5401转入致弱沙门菌中表达制得DNA疫苗，攻毒保护性试验结果表明，带有pcDNA3-5401的沙门菌能够诱导强烈的体液免疫和细胞免疫应答，进而抵抗柔嫩艾美耳球虫强毒攻击，但是，沙门菌的稳定性和生物安全性还有待进一步研究。李安兴等人[14]对B-I株SO7重组抗原进行免疫试验时发现，小剂量(10g)免疫鸡时基本不产生免疫保护力，大剂量(100μg)SO7重组抗原免疫鸡时，能够产生部分免疫作用；而采用混合免疫方法，即先用SO7重组抗原进行基础免疫，再用球虫活苗(强毒株和弱毒株)进行加强免疫，则会产生互补加强的功效，其保护效果与用球虫活苗2次免疫的效果相同。这种方法降低了成本，减少球虫活苗的用量，同时还可以减少免疫后鸡的卵囊排出量，降低了环境的污染程度，减少了重复感染的风险。Kopko等[15]首次用DNA(pcDNA3.SO7)免疫接种鸡，发现相比用活卵囊和重组蛋白抗原(CheY-SO7)免疫的鸡而言，盲肠病变减轻和相对体重增加。丁熙成等[16]用pET载体经原核表达的EtMIC-2，通过口服、肌注不同剂量工程活菌和菌体裂解蛋白的方式，免疫7、14日龄鸡两次，1 周后再用 E.tenella、E.acervuzina、E.maxima 攻毒，证明经原核表达的的EtMIC-2基因表达产物对E.tenella的额保护作用最强，其它两种也有保护作用，但程度稍弱，且口服方式比肌注方式效果明显。秦睿玲[17]用柔嫩艾美耳球虫子孢子kMzp5-7基因在大肠杆菌中的表达产物，分别给7日龄、14日龄和28日龄的海兰小公雏通过口服工程活菌和肌肉注射菌体纯化蛋白两种方式连续3次免疫，结果也显示口服方式的免疫效果优于肌注免疫组。Lillehoj等[18]用3-1E cDNA与编码鸡细胞因子(IL-8或IL-15)的cDNA联合免疫鸡，发现对十二指肠内皮的CD3+T细胞有明显的增殖作用。

3 展望

综上所述，随着科技和相关生物学科的发展，关于鸡球虫各方面的研究都进入到细胞和分子层面，但是球虫复杂的生活史依然给相关研究带来了一定的困难，其抗原蛋白的种类、其免疫原性以及保护性免疫机制等，都亟须进一步的发展，通过这些基础性的研究进一步摸清球虫的分子生物学特性，筛选球虫不同阶段的关键保护性抗原以及球虫对宿主免疫系统的影响和免疫应答机制等问题，为球虫病的防治提供新的更加有效的途径。