应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊生长性能、血液生化指标和瘤胃内环境的影响

2020-02-13史金平李秀琴李晓梅张全伟杨海峰高兴超成述儒

饲料工业 2020年1期

史金平李秀琴马武李晓梅张全伟杨海峰高兴超成述儒*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省金昌市永昌县兽医局朱王堡兽医站，甘肃金昌737206；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

我国牧区受极端气候的影响较大，特别是每年冬春季节严寒加暴雪使放牧绵羊无法正常放牧采食，且牧区缺乏应急草料，常出现家畜掉膘、出生幼畜成活率低的现象，严重影响牧区畜牧业的发展。我国作为农业大国，秸秆资源极为丰富，其中小麦秸秆和玉米秸秆是主要的两种农作物秸秆资源，但是秸秆资源被作为粗饲料资源加以利用的比率较低。现阶段，秸秆主要用于制作饲料，秸秆类饲料获取较廉价，且具有很高的利用价值，已经被加工成颗粒饲料在很多家畜饲养及育肥中应用。雒秋江等[1]研究表明，玉米秸秆粉粹制成粒后可显著提高采食量，提高日增重；周封文等[2]研究发现，绵羊在采食秸秆颗粒日粮后，绵羊对日粮的自由采食量显著增加，同时绵羊对日粮中营养物质的消化量也增加，但会显著降低绵羊的日粮消化率。如何将农作物秸秆加工成为应急饲料，为冬春季节的高山细毛羊提供营养补给，成为北方牧区人们所关注的主要问题之一。因此，本试验利用小麦秸秆和玉米秆分别制作成放牧羊应急全价颗粒饲料，研究其对甘肃高山细毛羊泌乳母羊体重、血液生化指标及瘤胃内环境的影响，检验应急专用颗粒饲料的价值，为牧区极端气候条件下放牧绵羊应用应急专用颗粒饲料的生产提供饲料配方和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点

在甘肃省肃南裕固族自治县养殖场进行，饲喂以玉米秸秆和小麦秸秆为主的应急全价颗粒饲料。颗粒饲料具体制作过程如下：

①小麦秸秆和玉米秸秆粉碎用9RSJ 型揉丝粉碎机，人工将各配料混匀，待制粒；

②先将制粒机提前预热半小时。然后将混合均匀的粉料加入颗粒机，随机器的运转颗粒饲料制成。如果第一次成形效果不好，需要进行二次制粒；

③冷却：颗粒料加工出来时温度比较高，颗粒易碎，不能直接装袋，必须将其放置冷却后再装袋，否则容易发生霉变等；

④包装：因为本次生产的颗粒饲料都是用于本试验，不进行出售所以只是简单的用编织袋装起来，放置在干燥的地方，以备试验待用。

1.2 试验设计

试验采用单因子设计，选择18 只[平均体重：(39.8±0.83) kg，产后(15±5) d]生长状况良好的甘肃高山细毛羊泌乳母羊，随机分成3 个处理组，每组6 只，试验组分别饲喂应急饲料1（EW）和应急饲料2（EC），对照组（CON）正常放牧，试验期15 d。根据中国美利奴羊饲养标准和甘肃高山细毛羊的放牧采食量确定，EW和EC每天分别投喂1.88 kg和1.86 kg。

1.3 应急饲料配方及营养水平

应急饲料配方是根据中国美利奴羊饲养标准和甘肃高山细毛羊放牧采食量配制[3]，以玉米秸秆和小麦秸秆为主，并通过玉米、麸皮、糖蜜、大豆粕、棉籽粕等调整饲料组成。饲料配方和营养水平以及肃南牧区春季牧草营养水平详见表1。

1.4 样品采集与测定

1.4.1 生长性能的测定

试验正式开始、结束日晨饲前逐一称重并计算每处理组的平均日增重。

1.4.2 血液样品的采集与测定

试验结束日晨饲前每处理组选取接近试验组平均体重的4只羊，静脉采血于10 ml的真空采血管（不含抗凝剂）中，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清保存于-20 ℃待测。血清样品中的各生化指标含量采用标准试剂盒（北京天根生物有限公司）进行测定，用比色法（科华KHB-1280 全自动生化分析仪）测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、总胆固醇（T-CHOL）、葡萄糖（GLU）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和甘油三脂（TG）的浓度。

表1 试验饲料配方及营养水平(%)

1.4.3 瘤胃液体样品的采集与测定

试验结束日晨饲2 h 后，分别于各处理组试验羊中随机选择4 只，采用灭菌的口腔导管抽取瘤胃液50 ml 置于采样管中，立即测定其pH 值，经四层纱布过滤后，投入液氮罐带回实验室于-70 ℃保存待测。

①雷磁PHS-2F 型酸度计测定瘤胃液pH 值；Ketuo KDY-9830凯氏定氮仪测定总氮；苯酚-次氯酸钠测定氨态氮；脲酶（试剂盒由南京建成生物工程研究所提供）法测定瘤胃液尿素；参照李勇等[4]方法测定挥发性脂肪酸(VFA)。

②瘤胃微生物表达量测定

引物设计：根据GeneBank白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的16S rRNA序列，真菌、原虫的18S rRNA序列，利用Premier 5.0 软件设计特异性引物（上海生物工程有限公司合成），详见表2。

瘤胃微生物总DNA 提取与样品测定：利用天根（北京）粪样DNA 提取试剂盒（DP328）进行瘤胃微生物总DNA 的提取。瘤胃微生物定量采用荧光定量PCR（Real Time PCR）比较阈值法，目的菌相对含量计算采用2-△△Ct法。PCR 反应体系及反应参数参照Roche 试剂盒（Gat.No.06402712001）说明书进行。反应体系（20 μl）为：Master Mix 10 μl，模板2 μl（20 ng），上下游引物各0.6 μl，ddH2O 6.8 μl。60 ℃退火10 s，40个循环，在延伸期收集荧光信号。

表2 瘤胃微生物RT-PCR的引物序列

1.5 数据分析

2 结果

2.1 对生长性能的影响

表3 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊生长性能的影响

由表3可知，饲喂EW和EC的泌乳母羊试验前体重和试验后体重均与CON 相比差异不显著(P＞0.05)；饲喂EW和EC的泌乳母羊日增重比CON显著提高了28.77%和28.18%(P＜0.05)。

2.2 对血液生化指标的影响

由表4可知，饲喂EW和EC的泌乳母羊血清中总蛋白、白蛋白、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、乳酸脱氢酶、血糖的浓度均与对照组无显著差异(P＞0.05)；饲喂EW 和EC 的泌乳母羊血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的浓度显著高于CON(P＜0.05)。

表4 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊血液生化指标的影响

2.3 对瘤胃内环境的影响

2.3.1 总氮、蛋白氮、氨态氮、尿素氮

由表5可知，饲喂EW和EC的泌乳母羊瘤胃液总氮、蛋白氮、氨态氮和尿素氮含量均与CON 无显著差异（P＞0.05）。

2.3.2 瘤胃液pH值及挥发性脂肪酸

由表6 可知，饲喂EW 和EC 相比CON 对泌乳母羊瘤胃液pH值、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和VFA无显著影响(P＞0.05)。

2.3.3 瘤胃微生物相对表达量

近日，国家卫健委、国务院扶贫办联合印发的《贫困地区健康促进三年攻坚行动方案》（以下简称“《方案》”）提出，到2020年实现贫困地区居民健康教育全覆盖。

表5 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃液总氮、蛋白氮、氨态氮和尿素氮含量的影响(mg/100 ml)

表6 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃液pH值及挥发性脂肪酸含量的影响

①瘤胃微生物总DNA的提取及检测结果

将提取的瘤胃液总DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测见图1，同时用超微量分光光度计测定其浓度和纯度，OD260/280 值介于1.8～2.0 之间，可以用于后续的试验。

②RT-PCR扩增产物特异性

荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测见图2，其特异性和稳定性较强，产物为目的产物。进行RT-PCR 反应，结果如图3 所示，扩增效果良好，Ct值适中，定量准确，空白对照无扩增。真菌和细菌的溶解曲线也都呈现特异性扩增单一峰图（见图4），无引物二聚体或其它非特异性产物等引起的杂峰，荧光曲线能够准确反应目的产物扩增结果的变化，进一步说明扩增效果良好，定量准确。

③泌乳母羊瘤胃微生物相对表达量

由表7可知，饲喂EW和EC的泌乳母羊瘤胃液微生物白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、真菌和原虫的相对表达量与CON差异显著(P＜0.05)。

图1 DNA的琼脂糖电泳检测图

图2 RT PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

图3 真菌(A)和细菌(B)的扩增曲线

图4 真菌(A)和细菌(B)的溶解曲线

表7 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃微生物相对表达量的影响

3 讨论

3.1 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊生长性能的影响

日增重（ADG）是反映动物采食量和饲料转化率变化的重要指标，能直观地体现动物对日粮的吸收和消化。本试验中饲喂EW和EC对甘肃高山细毛羊泌乳母羊的日增重有显著的影响，饲喂EW的泌乳母羊日增重为122.48 g，饲喂EC 的泌乳母羊日增重为121.92 g，而CON的泌乳母羊日增重最慢，为95.11 g，可能是肃南牧区春季气候寒冷，牧草长势差，母羊以采食黄草为主，营养相对缺乏。研究发现，在冬春牧草匮乏季节补饲，母羊在高能量蛋白日粮摄入组母羊的平均日增重显著高于低能低蛋白摄入组，随能量和蛋白水平的升高，日增重呈正增长趋势[5]；王中华等[6]研究发现，瘤胃中丙酸比例升高时，体内氮平衡也随之增高，丙酸对体脂肪体蛋白沉积及代谢能用于增重的效率有明显的促进作用，这与本试验的研究结果基本一致。

3.2 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊血液生化指标的影响

动物机体的血液生化指标能够反映体内营养状况和部分组织器官机能变化情况，同时受日粮的营养水平、发育阶段以及自身内分泌状况等因素的影响[7]。

血糖作为动物机体最直接的供能物质，是合成各类蛋白、脂肪、糖原的能量来源，同时也作为底物参与蛋白质的合成[8]。本试验中试验组与对照组血糖含量差异不显著，但饲喂EW 和EC 的泌乳母羊的血糖含量高于CON，这与解进等[9]报道的北方牧区牧草产量比较低且蛋白质、能量的含量偏低的研究结果一致。饲喂EW和EC的泌乳母羊，因补饲水平接近，血糖浓度差异不显著，与钱利纯等[10]研究结果相符合。

血清蛋白是动物体内重要的能量功能物质，具有维持内环境渗透压和酸碱度、运输多种代谢物等的生理作用，并与机体免疫功能有着密切的关系。只要在正常精粗比范围内不影响母羊健康的情况下，总蛋白和白蛋白不会有显著的变化。本试验中试验组与对照组总蛋白与白蛋白含量差异不显著，同时试验组间也差异不显著，与周鹏等[11]研究结果一致。

血清尿素氮含量可以间接反应饲料的蛋白含量水平，也可较为准确地反映动物蛋白质代谢状况[12]。本试验表明饲喂EW和EC对甘肃高山细毛羊泌乳母羊血清尿素氮含量影响不显著，但饲喂EW 和EC 的泌乳母羊血清尿素氮含量低于CON，可能是因为EW和EC 饲粮与对照组饲粮物理状态和成分不同，试验组母羊瘤胃中微生物合成作用增强，氨态氮浓度低，蛋白氮升高，导致瘤胃壁吸收的氨降低，肝脏合成的尿素氮降低。谷草微生物合成作用增强，氨态氮浓度低，蛋白氮升高，导致瘤胃壁吸收的氨降低，肝脏合成的尿素氮降低。谷草转氨酶和谷丙转氨酶是反应肝脏健康的重要指标，在非必需氨基酸的合成和蛋白质分解代谢中起重要的中介作用[13]，其活性的高低可反映动物的生长速度等生长性能。本试验中饲喂EW和EC使甘肃高山细毛羊泌乳母羊血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量显著升高，可能是因为两种秸秆颗粒饲料的营养水平较高，促使泌乳母羊体内的氨基酸代谢加强。血清胆固醇的含量影响性激素、肾上腺皮质激素等的合成，是这些激素的重要前体物质[14]，血清中甘油三酯含量反应了机体对脂类的利用状况，当脂类消化吸收不好时，血清中胆固醇和甘油三酯浓度均下降。试验中试验组血清胆固醇含量和甘油三酯含量与对照组差异不显著，说明补饲秸秆颗粒饲料对泌乳母羊无不利影响，同时也说明试验组泌乳母羊对体内脂肪的利用较对照组泌乳母羊少，更有利于泌乳母羊机体能量的储存。

3.3 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃内环境的影响

3.3.1 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃液总氮、蛋白氮、氨态氮、尿素氮的影响

反刍动物瘤胃液中氮主要来自于其对采食饲料中粗蛋白的分解。瘤胃液中总氮包括蛋白氮、氨态氮和尿素氮，影响瘤胃总氮降解的因素不仅包括饲粮氮本身的物理特性和化学特性，还包括瘤胃及其内容物的特性[15]。本试验中各组间总氮含量差异不显著，但饲喂EW 和EC 的泌乳母羊瘤胃液总氮含量有高于CON的趋势，这与试验组饲粮中粗蛋白含量较高有关。

瘤胃液蛋白氮包括三部分，即饲料中可降解蛋白氮、唾液蛋白氮以及微生物蛋白氮，在一定情况下表明微生物蛋白质的合成情况。本试验中饲喂EW 和EC 对泌乳母羊瘤胃液蛋白氮影响不显著，可能是因为反刍动物采食颗粒饲料时间短，反刍次数少，唾液蛋白对瘤胃液蛋白贡献小；试验组瘤胃液蛋白含量有高于对照组的趋势，可能是因为颗粒饲料中蛋白含量大于牧草中蛋白含量。

瘤胃氨态氮作为瘤胃微生物生长和蛋白质合成的重要氮源，其浓度适宜范围为5.00～30.00 mg/dl，本试验中各组瘤胃液氨态氮浓度（8.92～10.03 mg/dl）均在适宜范围内。本研究中各组间氨态氮含量差异不显著，试验组瘤胃液氨态氮含量较对照组低，可能是因为试验组瘤胃微生物对氨的利用加强，瘤胃液中尿素氮的浓度受动物采食速度、饲料本身尿素氮的浓度、动物体内溶解速度、动物自身唾液分泌量及血液中氨态氮的浓度等多个方面的影响[16]。

瘤胃液尿素氮含量可反映机体氮代谢情况，浓度高说明体内蛋白分解代谢增强，浓度低说明氮的利用率高。研究显示，瘤胃中脲酶的活性很高，可高出微生物利用NH3合成蛋白质的3 倍之多，所以瘤胃中尿素氮含量一般情况下都保持在一个较低的水平[17]。本试验中试验组与对照组瘤胃液尿素氮浓度差异不显著，范围是1.73～1.85 mg/100 ml，与郑琛[18]研究结果表明绵羊的瘤胃液尿素氮浓度变化相符。

3.3.2 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃液pH值及挥发脂肪酸的影响

瘤胃液pH值是一项反映瘤胃发酵水平的综合指标，它受饲粮性质、唾液分泌及瘤胃内酸、碱性物质排出、吸收的影响，但其变化的根本原因则是饲粮结构与营养水平[19]。瘤胃液pH 值降到5.5 以下时会发生瘤胃酸中毒。王庆丽等[15]指出，正常瘤胃液的pH 值在5.5～6.8 之间。也有报道称真菌生长最适pH 值是6.3～6.8[20]。本试验中各组间瘤胃液的pH值差异不显著，范围是6.62～6.87，与上述学者的研究结果一致，说明补饲秸秆全价颗粒饲料对甘肃高山细毛羊妊娠母羊瘤胃液的pH值无不良影响，能保持瘤胃内环境稳定，保证瘤胃中各类微生物对秸秆颗粒饲料的降解供能。

乙酸、丙酸和丁酸是主要挥发性脂肪酸，约占总挥发性脂肪酸的90%以上，其中乙酸占到总挥发性脂肪酸的70%左右，反刍动物消化吸收碳水化合物的方式为挥发性脂肪酸而不是葡萄糖。在挥发性脂肪酸生成的过程中会同时释放出ATP，为微生物的生长繁殖提供能量。挥发性脂肪酸的产生使瘤胃维持一个较理想的酸性环境，适合微生物繁殖和寄生，使瘤胃处于一个良性动态平衡的环境。反刍动物通过瘤胃微生物对饲料的发酵消化而获得主要的能量来源，对碳水化合物吸收的形式不是葡萄糖而是一些短链的挥发性脂肪酸，其包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、正丁酸等，且瘤胃发酵类型及挥发性脂肪酸产量与饲粮的类型密切相关。李旺[21]研究发现，挥发性脂肪酸是反刍动物主要能量的来源，也是合成乳脂肪和体脂肪的主要原料，精料的比例与挥发性脂肪酸的总量呈正相关。本试验中各组泌乳母羊瘤胃液中乙酸比例、丙酸比例、丁酸比例、戊酸比例、异丁酸比例、异戊酸比例和挥发性脂肪酸总量差异均不显著，但EW和EC挥发性脂肪酸丙酸比例高于CON，丙酸比例提高意味着能量利用率提高，甲烷产量降低，说明EW和EC可提供较高能量。

3.3.3 应急饲料对甘肃高山细毛羊泌乳母羊瘤胃微生物表达量的影响

瘤胃微生物是一个相对稳定、但又处在持续动态变化中的微生物群落，是共生在反刍动物瘤胃中细菌和原生动物等微生物的总称，主要包括细菌、原虫、真菌和噬菌体等几大类。研究指出瘤胃微生物的组成和分布受到多种因素的影响，其中主要因素有遗传、日粮和环镜等[22]。

原虫是瘤胃中个体较大、数目较多的微生物，主要通过颗粒性淀粉和可溶性糖作为发酵底物参加宿主的消化代谢。瘤胃内真菌主要表现为对纤维的降解，此外也可以参与淀粉的降解。Chanthakhoun 等[23]研究表明，日粮中粗蛋白的水平对原虫和真菌的相对表达量无明显变化，Bauchop[24]报道饲粮对于瘤胃真菌群落有显著的影响，当反刍动物饲喂高纤维日粮时，瘤胃中真菌数量高于低纤维日粮组。Atasoglu等[25]也认为，日粮中纤维物质含量高的饲喂组，瘤胃中的真菌数量要大于日粮中纤维物质含量低的饲喂组。相对CON，饲喂EW 和EC 的泌乳母羊真菌和原虫的相对表达量显著降低，可能的原因是试验组日粮中粗纤维含量低于对照组。瘤胃纤维分解菌包括黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌等，主要作用是消化分解饲料中的纤维类物质。饲喂EW 和EC 的泌乳母羊瘤胃液微生物白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌相对表达量与CON 显著差异，且对照组表达量高于试验组，马惠忠[26]研究表明，日粮精粗比的不同会引起内蒙古白绒山羊瘤胃中纤维分解菌的拷贝数变化，随着日粮中的粗料比例增加，产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的表达量会增加。郭盼盼等[27]研究表明，如果日粮中粗饲料比例显著降低，会使得瘤胃中主要的纤维素降解菌的表达量显著降低，本试验的研究结果与以上两名学者的研究结果都相符。