微生物源类胡萝卜素的研究进展

邓永平 段 睿 王晓杰 艾瑞波 刘晓兰

(1.齐齐哈尔大学食品学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.黑龙江省普通高校农产品深加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

类胡萝卜素是由所有光合生物和一些非光合作用的古生菌、真细菌、真菌合成的具有多烯骨架的异戊二烯类化合物[1]。在动物饲料中添加一定量的类胡萝卜素，有利于改善动物体色和羽毛颜色，增加观赏性[2]；也有利于提高动物的生产性能、机体免疫力、繁殖效率等[3-4]，对增加养殖业的经济效益具有一定的推动作用。

通过生物（植物、微生物）提取法和化学合成法均可获取类胡萝卜素[1]。化学合成色素的安全性备受质疑，一些化学合成类胡萝卜素（如虾青素）已被发现有害并且禁止药店销售[5-6]。随着生物技术的发展和人们对食品安全的认识不断提高，生物提取法获得的天然来源的类胡萝卜素需求量越来越大。植物来源的天然类胡萝卜素生产成本相对较高，且受季节影响；而微生物来源的天然类胡萝卜素由于具有天然、高效、生产成本低、易实现工业化的优点而受到科研工作者的青睐。

本文对微生物来源的天然类胡萝卜素的开发现状进行了综述，以期为产率高、经济可行的微生物法制备类胡萝卜素提供新的思路。

1 微生物源类胡萝卜素的合成代谢途径

在产类胡萝卜素的微生物代谢中，异戊二烯焦磷酸（IPP）及其异构体二甲烯丙烯焦磷酸（DMAPP）是合成所有已知类胡萝卜素的共同前体物[7]。在古生菌、一些革兰氏阳性菌以及真菌中，IPP 是以乙酰CoA 为原料，经MVA 途径合成；而在大多数真菌和细菌（如E. coli）、藻类中IPP 和DMAPP 是以丙酮酸与3-磷酸甘油醛为原料，经MEP 途径合成；某些链霉菌属（Streptomycetes）同时具有上述两种途径[8]。

由MVA 和MEP 途径合成的IPP 及其异构化产物DMAPP 在异戊二烯转移酶的催化下以头尾连接的方式使碳链延长，合成牻牛儿基焦磷酸（GPP、C10）、法尼焦磷酸（FPP、C15）或牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP、C20）[9]。在八氢番茄红素合成酶（CrtB）催化下两分子的GGPP 尾尾连接，形成无色的八氢番茄红素（phytoene）。八氢番茄红素脱氢酶基因（CrtI）是将无色的类胡萝卜素转变成红色的类胡萝卜素的关键基因。在CrtI 的催化下八氢番茄红素多步脱氢，形成多种类胡萝卜素合成代谢的重要前体物——红色的番茄红素（lycopene）。番茄红素在番茄红素环化酶（CrtY）催化形成β-胡萝卜素（β-carotene）或含γ-环、ε-环的类胡萝卜素。随后，β-胡萝卜素经β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）和β-胡萝卜素酮酶（CrtW）的作用转化为玉米黄质（zeaxanthin）、角黄素（canthaxanthin）和虾青素（astaxanthin）。来源于不同菌株的β-胡萝卜素酮酶基因（crtW）会因其不同的反应特性催化β-胡萝卜素形成多种中间体，从而形成不同的类胡萝卜素[10-11]。

2 微生物产类胡萝卜素的研究现状

能够合成类胡萝卜素的微生物包括藻类、真菌、真细菌、古生菌等其中的某些属或种。类胡萝卜素作为生物体一种重要的抗氧化剂，其含量受多种氧化应激条件及前体物等的诱导，适当的采用刺激因素及诱导剂对培养过程进行处理有助于提高类胡萝卜素的产量。

2.1 微藻类胡萝卜素

微藻具有与高等植物相似的光合作用产能方式，是很有商业前景的类胡萝卜素产生菌[12]。微藻类胡萝卜素为9-顺式与全反式β-胡萝卜素异构体组成，相比于化学合成类胡萝卜素（全反式）具有更好的脂溶性和结晶性[13]。关于微藻产类胡萝卜素的研究已有较多报道，其中盐生杜氏藻（Dunaliella salina）、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）等是产类胡萝卜素的主要藻类。

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是天然β-胡萝卜素的最佳来源之一，在有强烈光照、高浓度盐、高温和营养缺乏的条件下，产量最多可占细胞干重的13%[14]，经超临界二氧化碳（SC-CO2）提取后产量可达115.43 μg/g 干微藻[15]。盐生杜氏藻产类胡萝卜素受光照和氮源的影响极大，培养后期氮源耗竭后，由于微藻细胞分裂速率的瞬时增加，细胞密度线性增加，光照下的生物量产量大约增加了一倍，同时，β-胡萝卜素开始在细胞内积累[16]。Prieto 等[17]利用开放式罐-封闭的管状光生物反应器两阶段培养盐生杜氏藻，在第二阶段控制氮源的条件下获得了最高的类胡萝卜素产量（328.8 mg/月），其中9-顺式与全反式β-胡萝卜素异构体比率（1.5）达到最高。Sui 等[18]采用缺氮和高光照两步培养法实现了盐生杜氏藻蛋白质和类胡萝卜素的联合生产，产量分别为22.7 mg/(l·d)和3 mg/(l·d)。

雨生红球藻是天然虾青素的最主要的来源。虾青素的生产过程包括细胞生长期（绿色）和胞内虾青素积累期（红色）两阶段。在细胞生长至稳定期后，营养物质逐渐匮乏，雨生红球藻细胞生长减缓，胞内开始积累虾青素[19-20]，这个过程受碳源诱导物、光呼吸作用以及初始生物量密度（IBD）等因素影响。在培养基中加入一定量的有机碳源可显著提高虾青素的产量。Cordero 等[21]在雨生红球藻培养基中添加0.30 mM 和0.60 mM 乙酸钠可分别使虾青素产量提高1.83%和1.78%。Pan-utaia 等[22]在培养基中添加100 mM 乙酸钾可进一步提高虾青素的产量至286 g/l，较对照提高了285%。IBD 是影响雨生红球藻细胞活力和生产力的一个重要因素，IBD 低易引发严重光抑制光合作用，IBD 高引起个体细胞的严重光限制易造成虾青素产量降低，在0.8 g/l 初始生物量密度下培养H. pluvialis FlotowK-0084 的虾青素产率最高为17.1 mg/(l·d)[23]。此外，光呼吸直接促进虾青素代谢途径关键中间产物三磷酸甘油酸水平，可以加速雨生红球藻中的虾青素积累[24]。

除了盐生杜氏藻和雨生红球藻外，研究人员在其他藻类中也发现了类胡萝卜素。Sivathanu 等[25]利用HPLC-NMR 和LC-MS-APCI 对土生绿球藻产类胡萝卜素进行了表征，发现其包含紫黄质、虾青素、叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素6 种组分。经二氯甲烷提取，在淡水藻中型鞘藻（Oedogonium intermedium）中提取到类胡萝卜素，其含量达(3 411.2±20.7) μg/g，经HPLC-PDA-APCI-ITTOF-MS 鉴定到包括新黄素、9'-顺式-新黄质、洛罗黄质、紫黄质、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素共七种主要的类胡萝卜素，具有显著的抗氧化活性[26]。此外，在细小裸藻（Euglena gracilis）类胡萝卜素生物合成时，β-胡萝卜素羟化酶基因EgCYP97H1 是类胡萝卜素生物合成必需基因，编码β-胡萝卜素单羟化酶，在转录后调节该藻类中生物合成光敏性类胡萝卜素[27]。

高光强度、高盐度、极端温度和氮缺乏等应激条件是增强藻类细胞中类胡萝卜素积累的主要因素。当光强度高于微藻光合作用所需的光强度时，就会过量产生β-胡萝卜素以克服光胁迫和潜在的光氧化损伤[28]。另外，通过基因水平进行调控，成为了提高微藻类胡萝卜素产量的新手段。通过蓝光可诱导虾青素的生物合成途径基因psy、pds、dgat1 和dgat2d 上调表达，从而使雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）积累了大量的虾青素，分别比白光和红光高4.0倍和6.7倍[29]。

2.2 真菌类胡萝卜素

真菌类胡萝卜素一般为C40 或C40 衍生物。产类胡萝卜素真菌包括三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）等。

B. trispora隶属于毛霉目，是目前少数已用于商业化生产类胡萝卜素的菌种[30]。该菌在（-）和（+）菌株有性繁殖阶段产生的接合孢子与类胡萝卜素的合成密切相关，在接合孢子形成中八氢番茄红素合成酶的含量快速提高，与此同时，类胡萝卜素含量也快速增加[31]。B. trispora合成的类胡萝卜素种类受碳源的影响，当以乳糖类为碳源时，优先合成全反式-β-胡萝卜素[31]；当以油脂为底物时，可增强β-胡萝卜素产量，而番茄红素的产量有所降低[32]；当有性繁殖培养基中添加乙酸钠时，乙酸钠通过柠檬酸循环转化为甲羟戊酸酯合成异戊二烯的底物乙酰-CoA，提高B. trispora中β-胡萝卜素的生物合成参与基因hmgR、ipi、carG、carRA 和carB 基因转录水平，使β-胡萝卜素的产量提高80%以上[33]。

B. trispora在外源干预下可积累番茄红素。三丙胺通过抑制环化酶活性，并通过上调与萜类生物合成相关的基因的表达，来增强B.trispora的番茄红素含量，经1.8 g/l 三丙胺处理2 d 后，番茄红素的比例从总类胡萝卜素的1.7%增加到90.1%，产量达到83.2 mg/g 干物质，是对照组的315.8 倍[34]；双功能蛋白基因carRA 编码八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶，为了提高番茄红素的产量，Wang 等[35]对carR和carA基因敲除菌株以及carA过表达菌株进行了研究，发现carRA 基因收到破坏会使菌株丧失合成类胡萝卜素的能力，而carA 过表达菌株使番茄红素含量增加了2.26倍。

粗糙脉孢菌孢子呈橘红色或黄色，内含番茄红素、红酵母烯、链孢霉黄素、β-胡萝卜素等多种类胡萝卜素[36]。O2和H2O2刺激可触发光诱导的粗糙脉孢菌类胡萝卜素的合成[37]。此外，在低温下经光诱导可提高结构基因的mRNA水平，也有利于类胡萝卜素产量的提高[38]。

X. dendrorhous是商业生产虾青素的优势菌，但虾青素的产量相对较低[39]。Marcoleta Andres 等研究了乙醇与虾青素合成的关系，发现乙醇的合成受抑制时有利于虾青素的积累，这一结果在Xiao的研究中也被证实，此外，X. dendrorhous菌体代谢产物如菌体蛋白、脂肪酸受抑制时也有利于虾青素的积累[40-41]。谷氨酸通过促进葡萄糖代谢，降低了TCA循环对乙酰辅酶A 的利用，而表现出对X. dendrorhous虾青素积累的积极影响，最大含量高达1.14 mg/g（DCW），比对照组高40.7%[42]。

Sakaki等[43]报道光辐射产生的氧化作用诱导了类胡萝卜素的积累，在光辐射条件，红酵母红素的产量比黑暗条件下增加180%。在解脂耶氏酵母培养基中添加烟草可增加总类胡萝卜素的产量[44]。Mahmoud Yolmeh 等[45]利用紫外线和叠氮化钠诱变粘红酵母（Rhodotorula glutinis）PTCC 5256，获得一株高产菌株，产量可达8.36 g/l。

2.3 细菌类胡萝卜素

细菌合成了迄今发现的所有C45 和大多数C30 和C50 类胡萝卜素，而其余的则由古细菌产生，类胡萝卜素数据库中包括来自170 种细菌的307 种类胡萝卜素和来自9 种古细菌的19 种类胡萝卜素[46]。

在红螺菌（Rhodospirillum rubrum）幼龄细胞中发现了番茄红素、螺旋黄素等类胡萝卜素[47]。通过代谢工程手段将球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的crtI4 基因导入Rhodospirillum rubrum中，敲除zwf 基因阻断了竞争性磷酸戊糖途径使番茄红素产量提高了88%[48]。陈亚淑等[49]对北极海洋红球菌（Rhodococcus sp.）B7740 产类胡萝卜素进行了鉴定，发现极端环境改变了类胡萝卜素的存在形式，在该菌株的代谢产物中存在2 种类胡萝卜素的衍生物——甲基萘醌类类胡萝卜素，通过液相色谱-质谱鉴定出2 种萘醌类类胡萝卜素，相对分子质量分别 为720.6 和718.6，化 学 分 子 式 是C51H76O2和C51H74O2。Tian 等[50]从极端环境中分离到了抗辐射球菌R13（Deinococcus xibeiensis R13），该菌在C/N 比为1∶5 和10 μMFe2+存在下可产抵抗γ射线和紫外线照射的类胡萝卜素，产量为6.64 mg/l，比原条件增加了84%。盛冉等[51]在鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffiiUL 发酵产物中提取到虾红素及较少的虾青素。

极端嗜盐古菌（Haloferax mediterranei）在含5%～28%NaCl（w/v）的条件下可产生具有强抗氧化特性的C50 类胡萝卜素，经HPLC-MS 检测到四种类胡萝卜素的异构体[52]。

3 未来研究方向

相对于植物而言，微生物来源天然类胡萝卜素的生产周期短，产率高，而且杜氏藻及三孢布拉氏霉类胡萝卜已经进入到工业规模生产阶段，但是还存在如下问题：①微藻类胡萝卜素的生产成本较高，无法与传统的化学合成方法和其他技术（例如从植物来源提取）竞争；另一方面，利用微藻类大规模生产虾青素生产周期长，且需要严格的控制和维护培养过程；②三孢布拉氏霉来源的β-类胡萝卜素生产周期长、菌体易衰退、关键基因的调控机理尚待进一步研究。

为了解决上述问题，可以从以下三方面展开研究：①降低类胡萝卜素生产成本。类胡萝卜素的生产原料往往占总成本的30%～70%，以工业、农业副产物作为廉价的营养来源是降低类胡萝卜素生产成本的一个主要途径，同时还可以提高工农业副产物的附加值。但是，为了使新生产工艺具有竞争力和可持续性，需要对新的原料的价格、来源进行评估。此外，针对类胡萝卜素种类选择特定碳源，适当优化基于工业、农业副产物的培养基的配方以确保高产类胡萝卜素，从而降低生产成本。②通过现代生物技术手段获得高产类胡萝卜素菌株。合成生物学方法可用于改善关键酶的活性，以生产合成代谢途径所需的代谢产物，通过合成生物学手段可以异源合成生产周期短、高产类胡萝卜素菌株。③开发新的、高安全性的类胡萝卜素高产菌株。