蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激作用研究

2020-02-13何晓涛韩蒙蒙杨雨辉

饲料工业 2020年1期

徐腾陈云杨鑫覃尧何晓涛韩蒙蒙杨雨辉

（海南大学动物科技学院海南省热带动物繁育与疾病研究重点实验室，海南海口570228）

热应激会严重影响鸡的生长[1-2]，破坏机体重要组织器官，尤其是对心肌组织的损伤更为显著[3]，并导致鸡因心力衰竭而应激性猝死[4]。研究表明，热应激状态下鸡的心肌细胞会出现严重的颗粒变性，出现空泡，核固缩甚至核碎裂[5]。张晓辉[6]研究发现阿司匹林通过诱导Hsp90表达有效抵抗体内外鸡心肌细胞热应激病理损伤。因此，探寻合适的药物来减缓热应激对心脏组织的损伤尤为关键。蟛蜞菊（Wedelia chinensis）为菊科多年生草本植物，味微苦、甘、性凉，具有清热、解毒、消炎、止咳、抗癌等功效[7]。Darah等[8]研究者发现，蟛蜞菊甲醇提物可以有效地抑制蜡样芽孢杆菌的生长作用。Huang等[9]研究发现在蟛蜞菊中提取的萜类化合物具有有效的抗血管生成活性。何仁春等[10]在鹅的日粮中加入蟛蜞菊可以有效提升鹅的生产性能和养分利用率，但蟛蜞菊提取物能否缓解鸡因热应激所导致的心肌组织损伤目前还未见报道。因此本试验通过构建文昌鸡胚原代心肌细胞体外模型，探究蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激的保护作用，为后续开发蟛蜞菊作为中药饲料添加剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验药物：蟛蜞菊，采自海南省海口市周边。

试验种蛋：购自海南省某文昌鸡孵化场。

DMEM/F12 培养基（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；100 倍青链霉素溶液（Gibco）；9 胶原酶Ⅱ（Sigma）；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu，Sigma）；噻唑蓝（MTT，Biosharp）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成）；谷草转氨酶（AST）试剂盒（南京建成）；BCA蛋白浓度试剂盒（南京建成）；DMSO 溶液（Biotopped）；RIPA裂解液（碧云天）；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天）；Hsp70小鼠单克隆抗体（Abcam）；GAPDH单克隆抗体（上海生工）；HRT标记的山羊抗小鼠抗体（上海生工）。

1.2 试验主要仪器

旋转蒸发仪（BUCHI）；低温高速冷冻离心机（Eppendorf）；CO2恒温培养箱（HealForce）；洁净工作台（苏洁净化）；生物倒置显微镜（Motic）；酶标仪（Thermo）；微量振荡器（江苏新康医疗）；恒温水浴锅（江苏金怡）。

1.3 试验方法

1.3.1 蟛蜞菊醇提物的制备

采用水浴辅助醇提法[11]提取蟛蜞菊醇提物。将蟛蜞菊茎叶用蒸馏水洗净后，放置于60 ℃的烘箱中烘干并粉碎过40目筛。取10 g粉末与100 ml 95%乙醇（固液比为1∶10），60 ℃水浴30 min，抽滤，收集滤液；回收滤渣，再加入100 ml 95%乙醇，重复操作3次，合并滤液。旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，加入DMSO溶解得到1 g/ml 母液。用DMEM/F12 培养基稀释至所需浓度（DMSO 终浓度≤0.1%）。

1.3.2 原代鸡胚心肌细胞的提取与培养

参考魏宗波等[12]和Gao 等[13]的方法，取12 胚龄文昌鸡胚心脏，用D-Hank's 洗涤并剪碎至1 mm3大小。加入0.12%胶原酶Ⅱ溶液并37 ℃水浴消化8 min，吸取上清液经过四层纱布后加入细胞培养液终止消化，弃去第一次消化液，重复上述至无明显组织块为止。将全部细胞悬液900 r/min离心6 min，弃上清，用培养液重悬沉淀并接种于培养皿放置在37 ℃、5% CO2细胞培养箱差速贴壁1.5～2 h。取细胞悬液用0.1 mM Brdu的培养液稀释至相应浓度，放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱待48 h后换正常培养液。

1.3.3 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞活性检测

采用MTT法测定不同浓度的蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞活性的影响。将细胞密度为1×104个/ml的细胞悬液接种到96孔板中，在分离纯化后，分别加入0、0.05、0.5、5、50 μg/ml蟛蜞菊醇提物培养液，每个浓度设置4个重复孔。将细胞放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养24 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培养4 h后弃培养液，再加入150 μl DMSO，酶标仪570 nm波长下测定各孔的吸光值。

1.3.4 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激活性检测

采用MTT法测定不同浓度蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞减缓热应激损伤的保护作用。将细胞密度为1×104个/ml的细胞悬液接种到96孔板中，在分离纯化后，将细胞分为热应激组与常温组：加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物培养液，每个浓度设置4个重复孔。热应激组将细胞板放置于45 ℃培养箱中处理4 h；常温组放置于37 ℃培养箱中培养4 h 后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培养4 h后弃培养液，再加入150 μl DMSO，酶标仪570 nm波长下测定各孔的吸光值。

1.3.5 谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶（LDH）含量测定

收集经热应激和常温处理后的细胞培养上清液，按照试剂盒说明书进行操作检测。

1.3.6 Hsp70蛋白表达含量测定

将细胞分为热应激组（加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物）和空白常温组。使用含有1%PMSF的RIPA 裂解液提取总蛋白，使用BCA 试剂盒测量总蛋白的浓度。然后采用Western Blot 技术检测细胞内Hsp70蛋白表达。将蛋白样品与SDS-loding Buffer 充分混匀后，煮沸变性10 min，-20 ℃下储存。在SDSPAGE电泳后，100 V电转90 min将蛋白转印至PVDF膜上。取转印好的PVDF 膜放置于含有5%脱脂奶粉的PBST 溶液中室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，显影并使用Gel-Pro Analyzer 对膜上的条带进行灰度定量分析。

1.3.7 数据统计分析

运用SPSS23.0统计软件分析数据，采用单因素方差分析（ANOVA），分析各组间差异的显著性，其中用“**”表示为P＜0.01 极显著差异，用“*”表示为P＜0.05显著差异。

2 结果与分析

2.1 文昌鸡胚原代心肌细胞的形态学观察

经消化后的原代鸡胚心肌细胞大多数呈圆形并悬浮于细胞培养液中，如图1中A所示。纯化培养48 h后，细胞基本上都已经贴壁伸展，伸出伪足并呈现梭形，同时细胞出现节律性自发搏动，如图1中B 所示。热应激处理4 h后，细胞开始出现萎缩现象，胞浆中出现大量细小的空泡，如图1中C所示。

图1 原代鸡胚心肌细胞形态学观察图（×400）

2.2 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞活性的影响

图2 不同浓度的蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞活性影响

如图2 所示，随着醇提物浓度增高，细胞活性总体呈上升趋势，且都高于浓度为0 μg/ml。当浓度为50 μg/ml和5 μg/ml时，细胞活性分别达到了（124.21±5.94）%、（115.34±3.10）%，活性极显著升高（P＜0.01）。

2.3 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激活性的影响

如图3 所示，随着蟛蜞菊醇提物浓度的增高，热应激组OD 值也随之增大。热应激组中浓度为5 和20 μg/ml 时，OD 值较浓度为0 μg/ml 的OD 值极显著升高了17.98%和25.93%（P＜0.01）。热应激组总体OD值均低于常温组总体OD值，但随着醇提物浓度的增高，热应激组与常温组两者OD值差距逐渐减少，在浓度为5～20 μg/ml 时，两者之间无显著性差异（P＞0.05）。

图3 不同浓度的蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激活性影响

2.4 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞上清液中AST和LDH酶含量检测

如图4所示，热应激组AST和LDH酶含量在醇提物浓度为0 μg/ml时均达到最高值，随着醇提物浓度的升高而降低，在浓度为5～20 μg/ml时极显著下降至最低（P＜0.01）。热应激组AST和LDH酶含量均高于常温组。在浓度为0 μg/ml 时，热应激组AST 和LDH 酶分别极显著高于常温组的29.00%与17.54%（P＜0.01），但随着醇提物浓度的升高，两者之间差距逐渐缩小，在浓度为5～20 μg/ml时，含量差距无显著差异（P＞0.05）。

图4 不同浓度的蟛蜞菊醇提物对细胞上清液中AST（A）和LDH（B）浓度的含量影响

2.5 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞的Hsp70蛋白表达的影响

如图5 所示，热应激空白组心肌细胞的Hsp70 表达量是常温空白组的1.92 倍，表达量极显著增加（P＜0.01）。热应激组中，随着醇提物浓度的升高，Hsp70表达量也随之升高。相比较于浓度为0 μg/ml 时，浓度为20 μg/ml 的Hsp70 表达量分别极显著升高了33.14%（P＜0.01）。

3 讨论

3.1 热应激对文昌鸡胚原代心肌细胞活性的影响

高温、高密度饲养环境下的畜禽常发生热应激反应[14]。急性热应激对机体心肌组织影响最为明显，不仅会破坏心肌细胞之间的紧密连接，还会损害细胞结构和功能[15]。本研究图1 中的B 和C 对比说明，在热应激处理后心肌细胞的形态上出现了明显皱缩和空泡现象，与Wu 等[16]、Xu等[17]研究结果一致。图3结果表明，热应激组OD 值均低于常温组说明热应激降低心肌细胞活性。

图5 不同浓度的蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞的Hsp70 蛋白表达的影响

3.2 蟛蜞菊醇提物对原代鸡胚心肌细胞抗热应激保护作用

蟛蜞菊作为重要的南药资源，因其资源含量丰富，廉价易得，且富含萜类、黄酮类、生物碱和挥发油类等多种活性物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒的作用效果[18-21]。Huang 等[19]研究表明蟛蜞菊水提物可以有效缓解小鼠右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎。Tsai等[20]研究表明，蟛蜞菊提取物通过阻碍AR信号通路抑制前列腺癌的生长。刘漫宇等[21]研究表明，蟛蜞菊醇提物通过p38蛋白使CNE-1细胞发生G2/M期阻滞，从而抑制CNE-1细胞的增殖。本研究中图2结果表明，随着蟛蜞菊醇提物浓度升高，心肌细胞活性也随之升高，这说明适量的蟛蜞菊醇提物可以有效提高心肌细胞活性。图3 结果显示热应激下的细胞活性表现出对醇提物浓度依赖性，在浓度为20 μg/ml达到最高值，说明蟛蜞菊醇提物对热应激处理下的心肌细胞起保护作用，缓解热应激对心肌细胞的损伤。

3.3 蟛蜞菊醇提物对热应激处理下原代鸡胚心肌细胞释放AST和LDH酶的影响

AST和LDH广泛存在于动物机体的心脏、肝脏和肌肉等器官组织中，是反应心肌细胞损伤程度的重要指标[5]。当正常细胞在受到某种应激情况下，细胞膜的通透性会增加，导致细胞质中的AST 和LDH 酶释放[6]。秦士贞[22]研究发现，在高温条件下心肌细胞上清液中的LDH 和AST 酶活性会随着高温处理时间的增长而增强。本研究表明原代心肌细胞在热应激作用下，上清液中的AST和LDH酶含量对比于常温组显著增高，说明热应激对心肌细胞造成了明显的损伤。但是随着加入蟛蜞菊醇提物浓度升高，上清液中的AST 和LDH 酶含量在逐渐减少，并均在醇提物浓度为20 μg/ml 时降低到最低值，接近常温组含量。结果表明，经适当浓度蟛蜞菊醇提物处理的原代心肌细胞可以在一定程度上缓解热应激所带来的损伤。

3.4 蟛蜞菊醇提物对热应激处理下原代鸡胚心肌细胞表达Hsp70的影响

Hsp70是热休克蛋白重要且高度保守的成员，其分子质量大约为70 KD[23]，具有调控细胞凋亡、提升机体免疫、增强细胞抗氧化性和分子伴侣等生物功能[24]。研究报道显示，在热应激条件下Hsp70 通过过量表达修复机体因应激所产生的损伤并缓解后期应激的影响[25]。本研究结果表明常温组的心肌细胞内的Hsp70 表达量比较低，热应激处理后细胞的Hsp70表达量极显著上升，也验证了上述观点。Tang等[26]研究人员发现，纯化的迷迭香提取物可以有效地提高在热应激下肉鸡的Hsp70和晶状体蛋白αB（CRYAB）的表达，缓解肉鸡受热应激的影响。Xu 等[27]研究表明，辅酶Q10通过增加热休克因子1（HSF1）的表达，加速HSF1与热休克元件（HSE）的结合，增加Hsp70的表达保护热应激下的鸡原代心肌细胞。本试验结果显示，热应激条件下心肌细胞的Hsp70 表达量表现出浓度依赖性，并在浓度为20 μg/ml 达到最高。结果表明Hsp70 在原代心肌细胞抗热应激效应中起到重要作用，蟛蜞菊醇提物有效缓解心肌细胞抗热应激损伤可能与提升细胞Hsp70的表达量其密切相关。