MMP-14、Endoglin和sEng在子痫前期患者中表达的意义及相关性分析

季燕雯，陈先侠

子痫前期是一种妊娠特异性疾病，主要表现为新发高血压和蛋白尿，是严重危害母胎健康的主要原因，其全球发病率为5%～8%[1]。目前子痫前期的发病机制不明，可溶性内皮糖蛋白(sEng)升高在子痫前期内皮损伤机制中占主导地位，且作为子痫前期预测因子较为明确，但对其升高机制研究尚不明确[2]。近年来,在肿瘤研究中发现基质金属蛋白酶-14(MMP-14)可能起到调控sEng释放的作用，因此本研究通过研究子痫前期患者胎盘中MMP-14、内皮糖蛋白(Endoglin)和血清sEng的表达及相关性，进一步探讨MMP-14、Endoglin和sEng在子痫前期发病机制中的意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2018年9月—2019年1月妇幼保健院分娩孕产妇血清及胎盘，早发型子痫前期20例为A组,晚发型子痫前期24例为B组，以同期择期行剖宫产的正常妊娠晚期产妇20例为C组。诊断参考《妇产科学》第九版，孕34周之前发病为早发型子痫前期，34周之后发病为晚发型子痫前期。纳入标准：单胎、孕妇年龄20～40岁；患者及其家属签署知情同意书；排除标准：孕前及孕期未合并内外科疾病。研究符合伦理学标准，经本院伦理学委员会审核批准。3组年龄、身高、体重、孕产次比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组孕妇一般资料比较

注：A组为早发型子痫前期患者,B组为晚发型子痫前期患者，C组为行剖宫产的正常妊娠晚期产妇

1.2仪器与试剂 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测采用雷杜RT-6500酶标分析仪；人sEng(ENG/sCD105)ELISA检测试剂盒购于上海源叶生物科技有限公司，兔单抗Anti-MMP-14抗体[EP1264Y](ab51074)、鼠抗人Endoglin单克隆抗体均购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3标本采集和实验方法

1.3.1标本采集：术前晨于空腹静息状态下抽取肘静脉血3 ml，静置30 min后立即离心(3000 r/min)10 min,分离血清,置于-80℃集中保存待测。所有孕妇均在分娩时取胎盘中央全层1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm组织块，包埋制作蜡块保存待测。

1.3.2实验方法

1.3.2.1胎盘中MMP-14和Endoglin水平：采用免疫组化法半定量检测。具体方法：烤片，组织切片脱蜡，细胞通透、封闭内源性过氧化物酶，抗原修复、暴露抗原决定簇，封闭非特异性蛋白，一抗孵育，二抗孵育，SP反应，显色，复染、脱水、透明、封片。利用Nikon 4500 显微镜摄片。MMP-14表达阳性结果为细胞质或胞核染色成棕黄色，Endoglin表达阳性结果为细胞膜染色为黄色或棕黄色，每张切片随机选取5个×200倍视野，计数阳性染色细胞数，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算光密度值。

1.3.2.2血清sEng水平：采用ELISA定量检测，先将sEng和生物素标记的抗体同时温育，洗涤后加入亲和素标记过的HRP，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，与酶结合物同时作用产生颜色，颜色的深浅和样品中sEng的浓度呈比例关系，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

2 结果

2.1胎盘中MMP-14、Endoglin与血清中sEng的表达情况 A、B组MMP-14、Endoglin和sEng表达水平高于C组，且A组高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。3组胎盘组织MMP-14阳性表达情况见图1。

表2 3组孕妇胎盘中MMP-14、Endoglin与血清中sEng含量比较

注：A组为早发型子痫前期患者,B组为晚发型子痫前期患者，C组为行剖宫产的正常妊娠晚期产妇;MMP-14为基质金属蛋白酶-14，Endoglin为内皮糖蛋白，sEng为血清可溶性内皮糖蛋白；与C组比较，bP<0.01；与B组比较,dP<0.01

图1 3组胎盘组织MMP-14阳性表达情况(SP×200)

A组为早发型子痫前期患者,B组为晚发型子痫前期患者，C组为行剖宫产的正常妊娠晚期产妇；MMP-14为基质金属蛋白酶-14

2.2MMP-14与Endoglin、sEng相关性分析 A、B组患者胎盘组织中MMP-14水平与血清中sEng、Endoglin水平呈正相关(r=0.941、0.776、0.770、0.279，P<0.01)。

2.3早发型子痫前期MMP-14与Endoglin、sEng的表达情况 早发型子痫前期发病孕周<28周、28～30周(不包括30周)、30～32周(不包括32周)各4例，32～34周(不包括34周)8例，发病孕周越早，胎盘中MMP-14、Endoglin水平与血清中sEng越高，差异有统计学意义(P<0.01)，但28～30周和30～32周比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 早发型子痫前期孕妇不同孕周胎盘中MMP-14、Endoglin与血清中sEng表达情况

注：MMP-14为基质金属蛋白酶-14，Endoglin为内皮糖蛋白，sEng为血清中可溶性内皮糖蛋白；与28～30周比较，bP<0.01；与30～32周比较，dP<0.01；与32～34周比较，fP<0.01

3 讨论

妊娠高血压综合征是一种严重危害母婴健康的妊娠并发症，早发型子痫前期占妊娠高血压综合征的0.9%，及时终止妊娠可终止疾病进展，但可能增加医源性早产和新生儿死亡率[3-4]。血管内皮细胞损伤、内皮功能激活、失调和结构损害是子痫前期病理生理改变的一个重要环节，改善内皮细胞功能可有效延缓疾病发生与发展。

sEng是由胎盘产生的内皮损伤性因子，与子痫前期发病密切相关。sEng可影响转化因子β的正常信号转导通路，引起转化因子受体复合物1与血管内皮细胞表面转化因子β受体Ⅱ无法顺利连接，从而导致转化生长因子β1(TGF-β1)的信号最终无法顺利传递到细胞内，阻碍滋养层细胞侵袭和迁移，最终致血管形成不良以及血管通透性增加导致血管内皮损伤[5]。Stepan等[6]研究表明，孕13～28周血清sEng升高往往预示着不良妊娠结局。因此，sEng参与疾病的发生发展，但其分子机制尚未明确[7-8]。

MMP-14作为基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的一种类型，在多种恶性肿瘤组织中过表达，且与肿瘤浸润、转移相关[9]。目前MMPs是药物设计具有吸引力的靶标，并且长达30年一直是抑制剂设计的焦点[10]。MMP-14可作为结直肠癌和乳腺癌中Endoglin的裂解蛋白酶，其主要机制为上皮TGF-β1的过量表达通过旁路方式产生水解基质蛋白前肽的信号，使原先以酶原形式存在的MMP-14具有活性，刺激上皮Endoglin的脱落，从而产生sEng促进肿瘤新生血管的形成及转移[11-12]。有学者认为胎盘组织以“伪肿瘤”的状态存在于孕妇体内[13]，氧化应激可能通过激活p38MAPK信号转导诱导Gadd45α过度表达影响MMPs的活性，以影响滋养层细胞的侵袭，并增加sEng的分泌，参与子痫前期的发病机制[14]。

关于MMP-14与sEng在妊娠妇女中的研究相对较少，对于MMP-14与sEng之间的相互关系处于在研阶段。Kaitu'u-Lino等[15]研究发现在合胞体化的BeWo细胞施用广谱MMPs抑制剂(GM6001)，特异性阻止MMP-14和Endoglin之间的相互作用，可有效降低sEng表达水平。Zhang等[16]研究发现，重度子痫前期患者的胎盘中MMP-14、Endoglin和血清sEng表达水平显著增加，MMP-14和Endoglin表现出共表达，共同定位在合体滋养细胞中；在其研究中发现在胎盘的母体-胎儿横截面，MMP-14可能作为切割蛋白酶切割Endoglin，然后将其细胞外结构域释放到母体循环中形成sEng。本研究结果显示，早发型子痫前期患者胎盘中MMP-14、Endoglin与血清sEng水平高于晚发型子痫前期及正常患者，对于早发型子痫前期的发病孕周进行观察发现，胎盘中MMP-14、Endoglin与血清sEng表达水平与发病早晚有明显相关性，发病越早，MMP-14、Endoglin与sEng的表达水平越高，但在孕28～32周时无明显差异，提示在孕28周以及32周是早发型子痫前期治疗的重要节点，这与许多学者认为早发型子痫前期以孕32周为界的观点相一致[17]。而胎盘Endoglin表达上调可能是由于代偿机制，即子痫前期胎盘滋养层浸润过浅，导致胎盘形成不良、缺血，Endoglin过表达促进TGF-β,并促进滋养层入侵和迁移补偿胎盘滋养层缺血。本研究显示，MMP-14、Endoglin与sEng的表达均存在正相关，且子痫前期患者中存在MMP-14过表达，提示MMP-14可调节sEng的高表达而来参与子痫前期进一步发展[18-19]。

子痫前期的防治一直是临床工作的重点与难点。高危人群中使用母血清sEng可作为子痫前期诊断的早期标志物，Hawinkels等[20]提出通过抑制MMP-14的表达阻止sEng升高可改善重度子痫前期临床症状，可能会从胎盘源性方向寻找该病的治疗方案。本研究结果显示，早发型子痫前期患者胎盘中MMP-14水平明显升高，胎盘中Endoglin也高于正常组，同时血清中sEng也随之升高，表明子痫前期患者胎盘中存在MMP-14和Endoglin的过表达，可调节sEng的升高，晚发型子痫前期患者也表现出这种关系。因此在临床研究中可通过抑制MMP-14的产生降低sEng的表达，为临床诊治子痫前期尤其是早发型子痫前期提供一种新的诊疗思路。

综上所述，MMP-14、Endoglin与sEng均在子痫前期患者中高表达，三者共同参与子痫前期的发生、发展，MMP-14可作为重要的调节因子，调节sEng的高表达，因此选择合适的方案进行干预可能有助于子痫前期的防治。MMP-14、Endoglin与sEng在子痫前期中的进一步关系应在动物模型中开展相关实验，以提高临床应用价值。