雌性生殖干细胞衰老相关因素及延缓措施的研究进展

钟志胜，洪雯丽，曹秀萍，聂 坤，唐子娟，谢 奇，李 佳*

(1.深圳市中医院, 广东 深圳 518034； 2.遵义医科大学珠海校区， 广东 珠海 519041；南昌大学 3.医学实验教学中心； 4.第二临床医学院； 5.护理学院 医学系；6.江西省生殖生理与病理重点实验室，江西 南昌 330006)

1 雌性生殖干细胞的概述

对雌性生殖干细胞(female germline stem cells, FGSCs)的研究最早始于2004年[1]，小鼠卵巢中非闭锁卵泡消耗速率小于卵泡闭锁速度，进而推测小鼠卵巢内存在卵泡更新，并认为小鼠卵巢内存在生殖干细胞(germline stem cells，GSCs)，并提出了FGSCs的概念，这一发现对卵泡池固定理论是一个重大挑战[1-2]。随后，分别在新生乳鼠、成年小鼠、大鼠及人卵巢组织皮层上分别分离出可体外传代并只表达干性和生殖系标志物的细胞，将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的细胞移植到不孕雌鼠中，可检测到了带BFP的成熟卵泡，子代中也有GFP阳性表达，此为FGSCs的存在提供了最直接证据[3]。因而，将FGSCs定义为是一类既能进行自我更新又能分化为卵母细胞的定向祖细胞。FGSCs位于卵巢皮层处，大小10～20 μm。不表达多能性Nanog、Sox-2以及减数分裂标志物Figla，表达干性c-kit和生殖性OCT-4、MVH等标志物[4]。

2 影响FGSCs衰老的可能因素和主要的信号通路

2.1 影响FGSCs衰老的可能因素

2.1.1 FGSCs巢与FGSCs衰老：干细胞存在于与一定范围的隔间里的干细胞巢[5]，干细胞巢是干细胞赖以生存的液体微环境，其成分复杂且状态可决定干细胞的存亡。文献显示，FGSCs生存的微环境为卵巢干细胞巢(niche)。FGSCs的衰老实为卵巢干细胞巢衰老，卵巢干细胞巢由niche细胞、细胞外基质、颗粒细胞、血管、免疫细胞及分泌的因子组成。

果蝇生殖干细胞巢上的伴生细胞在GTPase Rho调控下可直接作用于FGSCs，功能缺陷的Rho会使niche上的骨形态发生蛋白(bone morpho-genetic protein，BMP)信号异常活跃，造成异常的低分化的单生殖干细胞积累[6]。哺乳动物FGSCs巢的结构和功能尚不清楚，将带GFP 标记的年老小鼠卵巢组织移植到年轻小鼠卵巢，发现年轻小鼠卵巢组织内有GFP 阳性的始基卵泡表达；反之将GFP 标记的年轻小鼠卵巢组织移植到年老小鼠卵巢，发现移植后的年轻小鼠卵巢组织中卵泡数目减少[7-8]。表明FGSCs微环境(即干细胞巢)的衰老才是卵巢衰老的重要因素。

2.1.2 免疫系统与FGSCs衰老：胸腺是机体中最大的免疫器官，切除胸腺的小鼠卵泡耗竭更快[9]，可见免疫系统与女性卵巢功能密切相关。在卵巢中，免疫相关组分如单核衍生细胞MDCs、T细胞和B细胞对卵巢组织功能的维持均表现出十分重要的作用；其中MDCs能够在细胞分化到一定程度发出“停止效应”，使细胞保持在该分化状态下避免分化过度。但由于年龄或疾病造成免疫系统退化，卵巢则出现“形态静止”而功能丧失，进而诱发卵巢早衰或原发性闭经[10]。FGSCs的命运很大程度依赖于免疫细胞及其所分泌的细胞因子。

2.1.3 炎性因子与FGSCs衰老：卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)患者血清中TNF-α和IL-2 的水平较正常组明显下降，IFN-γ明显升高，提示相关炎性因子失平衡可能是卵巢早衰的重要原因[11]。一些非可控性、慢性、低度的炎性反应可导致免疫功能失调，后者进一步加重慢性炎性反应并导致炎性因子释放加剧免疫功能失调，形成恶性循环，且通过内源性机制诱发干细胞衰老[12]。衰老的FGSCs中炎性因子IL-2、TNF-ɑ增高，而抗炎因子IL-10、TGF-β含量下降，伴随着FGSCs 中MVH、Oct-4蛋白和抗衰老基因(SIRT-1、SIRT-3)表达降低，衰老基因(P21、P53)相关蛋白表达增高。提示FGSCs巢中的慢性炎性在引起FGSCs衰老中发挥着重要作用。

2.1.4 氧化应激损伤与FGSCs衰老：氧化应激(oxygen speices，OS)，指机体氧化与抗氧化系统失衡而产生过多活性氧(reactive oxygen speices，ROSs)自由基，超出机体自身的清除能力而引起的不良的应激反应。ROS可双向调控细胞的增殖和凋亡；适当浓度的活性氧有助于与细胞增殖相关的生长因子信号分子的激活相关[13]。OS会使干细胞损伤，多种器官衰老，在骨骼肌细胞中，过多的活性氧会造成骨骼肌干细胞死亡，形成病理性肌肉损伤，在造血干细胞中还会使造血干细胞活性下降[14]等。OS也是女性不孕的原因之一，OS会诱导丙二醛MDA和ROS积累，抗氧化酶表达下降，损伤线粒体，进而抑制卵巢颗粒细胞发展；同时还会引起卵巢炎性反应，降低卵巢功能。且氧化应激-慢性炎性相互促进，恶性循环：由氧化应激反应导致ROS增多，可经过NOD样受体3(NOD-like receptor pyrin domain-3, NLRP3)和NF-κB，引起一系列炎性反应，IL-1β、IL-8、TNFα分泌增加，这些细胞因子反过来促进氧化应激，加速衰老过程。

2.2 影响FGSCs衰老的主要信号通路

2.2.1 Wnt信号：Wnt信号通路的主要生物学作用为参与细胞的生存和增殖，同时也可调节多种干细胞的更新和维持。过度激活Wnt下游信号会间接导致该通路的β-连锁蛋白损失，引起FGSCs减少。经典Wnt通路为β-catenin依赖性通路，该通路能够调控干细胞更新。当其配体缺乏时，β-catenin会被磷酸泛素化降解进而导致FGSCs数量下降。果蝇体内的前端陪护细胞是FGSCs niche重要部分之一，将FGSCs锚定在niche中，该细胞分泌的Wnt4信号对卵巢正常形态维持很重要[15]。同时，帽状细胞特异性产生的Wnt6信号也是维持果蝇体内FGSCs的关键信号； Wnt6信号敲低时，FGSCs数量明显减少；但敲低其前端陪护细胞的Wnt6却对FGSCs数量无明显影响。此外，Wg信号是Wnt成员之一，在果蝇卵巢帽细胞中表达短程作用于护卫细胞，远程作用于卵泡干细胞，调控卵泡干细胞的活性[16]。

2.2.2 Dpp信号：dpp信号是促进FGSCs自身增殖的主要因子，其自身或其受体突变将加速FGSCs衰老损失；它的降低也不利于FGSCs巢边界的维持，进而影响生殖干细胞的正常招募，无法控制生殖干细胞池的大小[17]。在果蝇FGSCs巢中，帽细胞产生dpp[1,3-Di(4-pyridyl)propane, dpp]配体诱导dpp(生物皮肤生长因子)信号与其受体结合可引起下游Mad的磷酸化，进入生殖干细胞核内，抑制分化因子Bam来维持生殖干细胞的干性并诱导BMP靶标蛋白的表达。随着年龄的逐渐增加及机体的日益衰老，dpp信号的活性也随之减弱，导致FGSCs数量相应的减少。

2.2.3 Hippo信号：Hippo信号通路最初发现于果蝇体内，Hippo通路进化较为保守，在哺乳动物体内也存在，它对器官大小维持、细胞的增殖分化、组织修复再生很重要，通路紊乱会导致组织癌变[18]。既往研究显示，在果蝇体内敲除Hippo相关信号分子后，FGSCs巢成分末端纤丝细胞会表达增加，间接增加了FGSCs数量；Hippo干扰却没有与之相反的作用。在果蝇卵巢发展中，yki逐渐由泛素化表达，且在已分化为末端纤丝部分的细胞核中表达较少，抑制末端纤丝细胞增殖活性，调控果蝇干细胞巢的大小和数量[19]。

前期研究发现，Hippo通路的效应分子YAP1过表达通过慢病毒转染至不孕小鼠体内，可检测到卵泡再生，同时FSH和E2激素水平增加；而使YAP1沉默后，育龄小鼠的卵巢表面上皮检测到MVH和OCT4共表达量下降，两者共表达的的干细胞初步认为是FGSCs，同时它还表达Nanog/Fragilis/stella，说明Hippo通路的效应分子YAP1对激活FGSCs、改善卵巢功能尤为重要[19]。

2.2.4 Notch信号：Notch信号通路与Hippo通路类似，它的受体为单次跨膜蛋白，与胞外配体结合后诱导胞内受体区域水解切割并释放进入核内调控基因表达，在细胞生存(包括各种干细胞)过程中扮演重要角色，多数情况下Notch信号通路的生物学作用为阻止分化，维持干细胞池。FGSCs标志物MVH、OCT-4表达与Notch通路的信号分子如Notch1、Hes1、Hes5的表达有相同趋势，在FGSCs体外培养体系中加入Notch通路抑制剂DAPT，发现随着DAPT剂量增加，卵巢干细胞标志物MVH与OCT-4表达量随之增强[20]。此外也有研究发现，随着年龄衰老Notch信号活性增加，可弱化干细胞巢与FGSCs之间E-钙黏着蛋白的表达，加速了FGSCs从巢中丢失。

虽然目前认为慢性炎性和氧化应激及多种信号通路参与FGSCs衰老的调控，但慢性炎性和氧化应激通过何信号通路调控卵巢生殖干细胞衰老尚不清楚。

3 延缓FGSCs衰老的可行策略

3.1 抗慢性炎性反应和氧化应激

壳寡糖(chitin oligosaccharide，COS)是一种壳聚糖降解后的产物，易于人体吸收利用。壳寡糖具有抗氧化、抑菌、降血糖、控制肥胖等作用[21]。对小鼠连续一个月灌胃壳寡糖发现卵巢指数、卵泡数量、雌二醇水平和免疫功能增加，表明卵巢功能增强，同时FGSCs的标志物增强，且随COS浓度呈剂量依赖性，说明壳寡糖对FGSCs有保护作用，但目前相关研究还比较少。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是人类饮食营养中不可或缺的黄酮类化合物，葡萄籽、果皮等是其主要来源，它具有抗菌抗氧化抗癌作用[22]。目前，关于原花青素对FGSCs的直接作用报道极少，但它对生殖损伤具有改善功能的研究已有相关报道。猜测它对FGSCs抗氧化应激、延缓衰老具有有利作用，但后续还需进一步深入研究。

白藜芦醇(resveratrol，RSV)最初是在葡萄类植物中发挥抗逆境作用而被发现。Hain观察到在植物被真菌细菌感染部位白藜芦醇聚集增多，修复组织损伤。在女性生殖中增加卵巢储备量、减少闭锁卵泡、改善病理性卵巢障碍、增加卵母细胞数量、抑制卵巢癌迁移、推迟更年期、延缓卵巢衰老[23]；还可以通过增强JAK/STAT3信号通路调控周期蛋白、抑制分化、维持胚胎干细胞自我更新，但白藜芦醇与FGSCs之间的具体关系目前相关报道甚少。

3.2 调节相关信号通路和基因的表达

在衰老果蝇中敲低foxo的生殖干细胞在紫外照射1 d时，FGSCs依然能以正常速率分裂，说明FOXO存在可能抑制了FGSCs的分裂[24]。另外，敲低衰老果蝇FGSC的Tor观察到电离辐射1 d的果蝇生殖干细胞串珠状比对照组明显变短，Tor敲低时有更多的FGSCs退出了细胞周期；STAT3表现出了与FGSCs转移性结合的特征，其有400多个基因直接与FGSCs增殖有关[25]；sxl编码一种女性特有的RNA结合蛋白-Sex lethal，并对Notch信号通路起负调控作用，研究显示敲低sxl表达后Notch活性比对照组上升近0.5倍，猜测通过基因编辑上调sxl表达不失为一种增加FGSCs的有效手段。

分析小鼠FGSCs的全基因组多聚腺苷酸化发现，脱腺苷化利于果蝇FGSCs的发展，因此探索准确测量polyA长度的可行方法能有助于更好了解掌握FGSCs。果蝇emerin同系物Otefin是其FGSCs维持干性所必需的一种LEM结构域蛋白，若Ote突变可造成FGSCs出现分化障碍，致使FGSCs死亡。

3.3 激活剂或抑制剂调节

生殖干细胞的衰老虽然不可逆转，但可以选择使用一些外在的药物或食疗的方法延缓衰老进程。如使用Mtorc1抑制剂雷帕霉素可以抑制靶点超活化，抑制体内FGSCs分化进程，促进增殖，对维持生殖干细胞库起到重要作用[26]；AMPK激活剂如5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸、二甲双胍、氧化烟酰胺腺嘌呤等都能降低生殖干细胞的衰老速度。GSK-3抑制剂BIO可呈剂量依赖性增加FGSCs数量；另外随年龄发生的FGSCs衰老过程也可被胰岛素肽类药物抑制。

4 结论

FGSCs的发现是近十多年来的一个重大突破，它的出现打破了传统卵泡池固定理论，证明成年后女性有新生成卵泡的能力。卵巢自然衰老或病理性衰老表现在卵泡减少、少排卵或者不排卵，卵泡减少的本质原因是FGSCs数量下降。然而，由于FGSCs的命运受很多因素影响，所以了解它的调控因素对于预防、护理、治疗女性不孕具有重要意义，也可为将来深入研究FGSCs的某些调控机制提供方向。