Rev-erb激动剂SR9009通过降低自噬抑制人结肠癌细胞系HCT116增殖

石 光，宁 娜，侯晓鸿，孙 聪，原 媛，王 丽，王晓晖*

(山西医科大学 基础医学院 1.病理教研室； 2.形态学实验室， 山西 太原 030001)

结肠癌(colon cancer)是世界范围内的高发恶性肿瘤之一，2018年全球癌数据[1]报道新增结直肠癌约180万例，病死率接近50%。研究表明，结肠癌病死率高的原因之一是癌细胞的保护性自噬[2]，即癌细胞快速增殖消耗大量营养，导致部分癌细胞处于营养缺乏的微环境，这些癌细胞通过自噬途径吞噬破碎的细胞器回收营养，以维持其快速增殖。如果能有效地抑制这种自噬，则可限制结肠癌细胞的增殖活性。但是，目前临床抑制细胞自噬的手段有限，需要寻找安全有效的方案。有文献报道，包括自噬在内的代谢活动受到人体自身生物钟的调控[3]。多种生物钟基因中，调控代谢昼夜节律的血红素调节核受体(hemeregulated nuclear receptor，Rev-erb)包括Rev-erb α和Rev-erb β的基因与癌细胞自噬密切相关[4]。因此，从Rev-erb入手抑制肿瘤细胞自噬可能是一种有潜力的结肠癌治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人源结肠癌细胞系HCT116(山西医科大学生理学系保存)。

1.1.2 主要试剂：SR9009(MCE公司)；生物钟调节蛋白Rev-erb抗体(Affinity Biosciences公司)；自噬蛋白Beclin1、LC3、p62抗体(Abcam公司)；DMEM高糖培养基(HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素(Solarbio公司)；CCK-8试剂盒[东仁化学科技(上海)有限公司]；Real-time PCR引物(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与处理：将结肠癌细胞HCT116复苏后接种到直径6 cm培养皿中，加入3 mL DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清，1%青链霉素)，在细胞培养箱(37 ℃ 5% CO2)中增殖24～48 h，镜下观察细胞贴壁80%左右，即用胰蛋白酶消化收集细胞悬液(约107个/mL)；将细胞悬液均匀接种到6孔板中，上排3孔为对照(control) 组，下排3孔为SR9009组，培养24 h细胞贴壁后，向SR9009组加入适当体积SR9009使其终浓度为20 μmol/L，对照组加入相同体积PBS缓冲液作为溶剂对照，继续培养24 h，进行后续检测。

1.2.2 Real-time PCR检测Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的mRNA转录：6孔板培养细胞，每孔加入1 mL RNAiso plus裂解液，氯仿抽提总RNA，测吸光度值A260换算浓度，用PrimeScript kit 反转录为20 μL cDNA；取2 μL cDNA作为扩增模板加入96孔板，添加待测基因或内参RPLP0(一种核糖体管家基因)的上下游引物(表1)各1 μL，TB Green PremixEx TaqⅡ 12.5 μL，蒸馏水8.5 μL；反应体系：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环；55 ℃ 30 s；得Ct值，计算2-△△Ct，比较各组基因转录情况。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.3 Western blot检测Rev-erb, Beclin1, LC3和p62的蛋白表达：6孔板培养细胞，每孔加入1 mL RIPA裂解液(强)，冰上裂解30 min，刮下收集到1.5 mL离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心取上清即为蛋白样品，BCA试剂盒测蛋白浓度，兑上样缓冲液煮沸10 min；配制SDS-PAGE凝胶，上样电泳，80 V 40 min，进入分离胶后120 V 120 min，半干法15 V 15 min转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST缓冲液漂洗，4℃孵育一抗12 h，室温孵育二抗1 h，滴加100 μL ECL发光液曝光；ImageJ软件分析图片条带灰度值，判断蛋白表达量。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活性：将细胞悬液均匀接种到96孔板中，每孔100 μL，37 ℃培养24 h后细胞贴壁，将细胞分为4组：对照组、SR9009组、3-MA(3-methyladenine)组、rapamycin组。对照组加PBS；SR9009组用20 μmol/L SR9009处理24 h；3-MA组用20 μmol/L SR9009预处理12 h，再用5 mmol/L自噬抑制剂3-MA处理12 h；rapamycin组用20 μmol/L SR9009预处理12 h，再用100 μmol/L自噬激动剂 rapamycin处理12 h。各组处理结束后，每孔加10 μL CCK-8试剂，37 ℃保温2 h，酶标仪测450 nm吸光度值，吸光度值与细胞活性成正比。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 SR9009抑制HCT116细胞增殖

与对照组相比，SR9009处理组细胞之间空隙变大，细胞不堆叠增殖，细胞增殖能力降低(图1)。20 μmol/L SR9009即对细胞活性有显著抑制(P<0.05)；20 μmol/L SR9009处理细胞24 h后细胞活性已有明显下降(P<0.05)(图2)。

2.2 SR9009促进HCT116细胞Rev-erb α和Rev-erb β的转录及蛋白表达

SR9009处理组HCT116细胞的Rev-erb α和Rev-erb β转录水平都显著高于对照组(P<0.01)(图3A, D)，SR9009组HCT116细胞的Rev-erb α和Rev-erb β蛋白的表达都显著升高(P<0.05)(图3B,C, E,F)。

图1 Rev-erb激动剂SR9009抑制HCT116 细胞的增殖Fig 1 Rev-erb agonist SR9009 inhibited HCT116 cell proliferation (20 μmol/L 72 hours)

2.3 SR9009降低HCT116细胞自噬

SR9009处理组HCT116细胞的自噬相关基因Beclin1和LC3的转录水平显著下降(P<0.05)，但p62转录改变不显著(图4)；SR9009处理组细胞自噬蛋白Beclin1和LC3Ⅱ表达显著下降(P<0.05)，p62蛋白含量升高(图5)。

2.4 SR9009通过降低自噬抑制HCT116细胞活性

SR9009组细胞活性比对照组降低，3-MA组细胞活性比SR9009组下降(P<0.05)，rapamycin组细胞活性比SR9009组显著上升(P<0.05)(图6)。

3 讨论

结肠癌是一种高致死率的恶性肿瘤[1]。研究发现，在结肠癌化疗中，癌细胞的自噬有抵抗凋亡，维持增殖的作用[5]。如果能有效降低自噬，则可限制结肠癌细胞的不断进展。细胞自噬具有节律振荡的特点[6]。因此，可以通过昼夜节律这个天然调节器来抑制自噬。

A.SR9009 treatment doses; B.SR9009 treatment times; *P<0.05 compared with control group图2 SR9009抑制HCT116细胞的活性Fig 2 SR9009 treatment decreased HCT116 cell n=12)

A.relative Rev-erb α transcription; B.relative Rev-erb α expression; C.quantification of B; D.relative Rev-erb β transcription; E relative Rev-erb β expression; F.quantification of E; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

A.relative Beclin1 transcription; B.relative LC3 transcription; C.relative p62 transcription; *P<0.05, **P<0.01 compared with control group

昼夜节律的分子机制是由多个生物钟基因组成的转录翻译反馈环路[7]，其中Rev-erb(包含Rev-erb α和Rev-erb β)是一种重要的负调节基因，可以抑制代谢相关基因表达，Rev-erb一般在白天表达较低，而夜晚水平升高[8]，以维持代谢活动的昼夜节律。

A.relative Beclin1 expression; B.relative LC3 expression; C.relative p62 expression; *P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with SR9009 group图6 3-MA促进SR9009对HCT116细胞活性的抑制， rapamycin逆转SR9009对HCT116细胞活性的抑制Fig 6 Autophagy inhibitor 3-MA decreased HCT116 cell viability that suppressed by SR9009, meanwhile autophagy activator rapamycin increased the

SR9009是一种人工合成的Rev-erb小分子激动剂[9]。本研究使用SR9009处理体外培养的HCT116结肠癌细胞，发现HCT116细胞的Rev-erb表达相比对照组显著升高，表明SR9009可以在结肠癌细胞中激活Rev-erb。有文献报道，这类调节Rev-erb活性的小分子化合物是一种有潜力的新型抗癌药物[10]，激活Rev-erb可以抑制多种癌细胞的增殖，如乳腺癌[11]、胶质母细胞瘤[12]等。本研究用Rev-erb激动剂SR9009以不同剂量和处理时间干预HCT116培养，结果表明SR9009以剂量依赖和时间依赖的方式，有效持续地抑制结肠癌细胞的增殖活性，但其具体机制还不清楚。

Rev-erb除了调节代谢节律以外，也是一种自噬调节因子[13]。自噬通过溶酶体降解回收细胞内的物质，是一种重要的分解代谢活动。研究表明，在多种乳腺癌细胞系中，激活Rev-erb可以抑制细胞自噬[14]。本研究发现，用SR9009处理HCT116结肠癌细胞后，自噬启动蛋白Beclin1表达下降，自噬融合蛋白LC3表达减少，自噬降解蛋白p62积累增多，这表明SR9009使结肠癌细胞的自噬受到抑制。有研究报道，自噬抑制剂3-MA提升了人结肠癌细胞系HT-29对硫化舒林酸(一种非甾抗炎药)诱导其凋亡的敏感性[15]。本研究在SR9009预处理HCT116细胞基础上，用3-MA抑制自噬，细胞活性进一步降低；用rapamycin激活自噬，细胞活性显著回升，这表明SR9009抑制HCT116细胞增殖活性的机制确实是降低自噬。

综上所述，用SR9009激活生物钟调节基因Rev-erb，可以通过降低细胞自噬达到抑制结肠癌细胞增殖活性的目的。这为探索结肠癌治疗的时间生物学方案提供了理论基础。

志谢：感谢山西医科大学生理学系崔香丽教授、吴亚俐同学赠送HCT116细胞。