抑制miR-621表达促进人胃癌细胞系增殖、迁移和侵袭

陈国雁，冯晓波

(上海中医药大学附属第七人民医院 消化内科， 上海 200137)

胃癌(gastric cancer)是全球第4大常见恶性肿瘤，全世界每年有100多万新发病例，约有78.3万人死亡[1-2]。虽然近年来胃癌的治疗和诊断取得了重大的进展，但由于肿瘤易转移，超过70%的患者手术切除后仍会复发，因此早期发现良好的筛查生物标志物是降低胃癌病死率的最佳途径[3]。微RNA(microRNA,miRNA) 是一类高度保守的非编码RNA。miRNA在包括胃癌在内的多种恶性疾病中表达异常[4]。同时越来越多的研究表明miRNA可作为恶性肿瘤潜在的预后生物标志物和治疗靶点[5-6]。在众多miRNAs中，位于染色体13q的 miR-621在乳腺癌和肝癌中作用均被发现[7-8]。一项研究表明，由于13q缺失导致miR-621下调，诱周期调控的关键基因上调，导致去分化的肝细胞癌不受控制的增殖[9]。同时也有研究表明miR-621可作为乳腺癌预后标志物[7]。但目前miR-621在胃癌中的研究及其对临床的意义和生物学功能尚不明确。

本研究通过检测胃癌组织和胃癌细胞中miR-621的表达，评估miR-621对胃癌的预后价值，同时改变miR-621表达量，观察其对胃癌细胞恶性表型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者一般资料：收集2008年8月至2013年8月在上海中医药大学附属第七人民医院治疗的120例胃癌患者的癌及癌旁组织，所有样本均通过2名以上病理学专家明确病理诊断，且临床资料保存完整，无其他恶性肿瘤史，未接受其他手术治疗。按照美国癌联合委员会的第8版TNM分期系统(T是肿瘤范围的大小，N是扩散到附近的淋巴结，M是转移到远端)，Ⅰ-Ⅱ期患者共48例，Ⅲ-Ⅳ期患者72例。本研究经上海中医药大学附属第七人民医院医院伦理委员会的批准(沪医伦研：2008-057)，在患者知情且同意情况下使用临床样本，并对患者进行为期5年手术后随访及记录患者临床病理学资料。

1.1.2 细胞及试剂：人胃黏膜细胞系GES-1和人胃癌细胞系MKN-45、N87、HGC-27及AGS(美国模式培养物保藏所ATCC)；DMEM高糖培养基、胎牛血清、链霉素/青霉素双抗溶液(Gibco公司)；细胞培养板及Transwell小室(Corning公司)； RNA抽提试剂盒miRNA Purification Kit、反转录试剂盒miRNA cDNA Synthesis Kit及RT-qPCR试剂盒miRNA qPCR Assay Kit(Cwbiotech公司)；Trizol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司)；转染载体miR-621 mimic、miR-621 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC(RiboBio公司)；CCK-8细胞活力检测试剂盒(MedChemExpress公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组处理：均用含10%胎牛血清(FBS)和含1%青/链霉素的高糖DMEM培养基培养细胞。待细胞至对数增殖期进行细胞转染实验。转染试剂为Lipofectamine 2000，将细胞分为对照组(control)；mimic control 组：转染mimic control；miR-621 mimic 组：转染miR-621过表达试剂miR-621 mimic；inhibitor control组：转染inhibitor control；miR-621 inhibitor组：转染miR-621抑制试剂miR-621 inhibitor。转染6 h后进行换液，继续培养。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA：用Trizol分别提取癌和癌旁组织及转染后细胞总RNA，并将其反转成cDNA，然后根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行RT-qPCR检测组织和细胞中miR-621的表达量。RT-qPCR检测时以U6作为内参进行，使用2-ΔΔCt方法对miR-621的相对表达量进行计算。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖：将转染后处于对数期的细胞以每孔1 000个/孔细胞接种于96孔板中，每隔24 h进行检测，检测前向孔中添加10 μL CCK-8试剂，培养箱中孵育2 h后，检测490 nm处吸光度值，连续检测3 d，评估miR-621对胃癌细胞增殖能力的影响。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：在含有基质胶的Transwell上室中添加50 μL培养液放置培养箱中水化基膜30 min，取200 μL含3×104个细胞的悬液添加至Transwell的上室，下室添加500 μL含10% FBS的培养基。过夜培养后，将上室细胞及基质胶擦拭掉，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色20 min，双蒸水清洗后，显微镜下随机选取5个视野拍照并计数，检测细胞侵袭能力变化。迁移能力检测时，直接在上室中添加细胞即可，其他操作与侵袭相同。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-621 在胃癌组织和细胞中的表达水平

在胃癌组织中miR-621表达水平显著低于癌旁组织(图1A)(P<0.01)。此外，miR-621在胃癌细胞系中的表达水平明显低于正常胃黏膜细胞(图1B)(P<0.01)。

2.2 miR-621 表达量与癌患者临床病理特征之间的关系

miR-621的表达与胃癌患者的临床TNM分期(P<0.01)、肿瘤分化程度(P<0.05)及淋巴结转移(P<0.05)存在显著相关性(表1)，并且表现为miR-621表达水平较低时，胃癌患者的肿瘤分化程度较低、TNM分期为 Ⅲ-Ⅳ、有淋巴结转移能力。

表1 miR-621表达量与胃癌患者临床病理特征的关系

A.expression of miR-621 in normal tissues and cancer tissues was detected by RT-qPCR；*P<0.05 compared with normal tissues；B.expression level of miR-621 in normal gastric mucosa cells GES-1 and gastric cancer cell lines was detected by RT-qPCR； *P<0.05, **P< 0.01 compared with GES-1 group

2.3 miR-621在癌患者中的预后作用

对胃癌患者进行为期5年术后随访，患者总体中位生存期为42个月，miR-621低表达患者的中位生存期为36个月。miR-621低表达的患者生存率显著低于miR-621高表达的患者(log rank testP<0.001)。进一步探讨miR-621与其临床病理学特征对患者生存率的影响，对胃癌患者临床数据进行分析，miR-621是胃癌的独立预后因子(表2)(P<0.01)。

表2 胃癌患者总体生存率的多因素Cox回归分析

2.4 miR-621对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

miR-621模拟物组表达量显著高于对照组(P<0.001)，而抑制剂组miR-621的表达量显著低于对照组(P<0.001)。结果证明胃癌细胞的转染效率较高(图2A)。miR-621模拟物组的增殖能力显著低于对照组(P<0.05)，而miR-621抑制组的增殖能力较对照组显著增高(图2B)(P<0.05)。 miR-621抑制剂组的迁移和侵袭细胞数显著高于对照组(P<0.001)，而miR-621模拟物组的迁移和侵袭细胞数显著低于对照组(图2C,D)(P<0.001)。

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，外科手术是目前唯一根治的方法，随着手术、传统放化疗及新辅助治疗技术的不断提高和改善，早期胃癌5年生存率高达95%。然而，早期诊断率较低，多数胃癌患者诊断时已处于晚期，错过最佳手术时机，而晚期胃癌中因存在转移风险，所以胃癌患者总体预后较差[10]。因此寻找治疗的预测标志物和潜在治疗靶点对胃癌患者是必要的。

既往的研究已证实miRNA可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤发生与进展。而最近的研究发现异常表达的miRNA可以作为肿瘤诊断和预后标志物。例如miR-503可通过靶向HMGA2抑制WNT信号通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，是胃癌的预后标志物[11]。而miR-621已被报道为某些肿瘤抑癌因子参与肿瘤发生发展以及预后。如miR-621通过抑制FBXO11对p53的依赖性能增强乳腺癌细胞对PTX/CBP化疗的敏感性，是乳腺癌治疗的预测标志物和潜在治疗靶点[7]。下调miR-621可通过靶向CAPRIN1促进肝癌细胞的增殖[8]。

本研究检测患者癌及癌旁组织，发现miR-621在胃癌的表达量显著低于癌旁，且癌细胞的表达量也显著低于胃黏膜细胞。分析临床病理特征，发现miR-621表达水平较低的患者，其淋巴结转移能力强、肿瘤分化程度低且TNM分期为III-IV。说明miR-621可能是胃癌的潜在抑癌基因。对miR-621的临床意义进一步探讨，生存曲线和Cox回归分析证明，miR-621低表达的患者5年生存率较差，且是胃癌独立预后因子。这与miR-621在乳腺癌和肝癌的研究类似，证明miR-621具有作为胃癌预后标志物的潜能。

进一步研究miR-621对胃癌细胞生物学功能的影响。通过研究发现，抑制miR-621表达可显著促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。研究表明miR-621作为抑癌基因参与胃癌的进展，是潜在的疾病治疗靶点，但miR-621在胃癌中的分子机制尚不明确，需进一步探究。

总上所述，本研究证明miR-621在胃癌组织和细胞中的表达显著下降，并与胃癌的不良预后相关。同时抑制miR-621的表达会显著促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此miR-621可以作为胃癌的一个预后标志物，且上调miR-621的表达将有望成为胃癌治疗的新策略。

A.expression of miR-621 after cell transfection；B. changes in cell proliferation capacity were detected by CCK-8 assay；C.number of cell migration was detected by Transwell assay；D.number of cell invasion was detected by Transwell assay；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group