红景天甙诱导骨肉瘤细胞系凋亡并抑制上皮细胞-间充质转化

谭 雄，陈 洁，毕国善，申 昕，戴先鹏，颜红霞

(南华大学附属第二医院 血管疝儿童普外科， 湖南 衡阳 421000)

骨肉瘤(osteosarcoma)是一种常见的儿童恶性骨肿瘤，具有局部侵袭性及较高的转移率，早期就可转移至全身非骨骼器官，尤其是肺部[1-2]。目前，临床针对骨肉瘤患者通常采用手术联合化疗的治疗方案。尽管能够在一定程度上改善患者病情，但其中20%的原发转移性骨肉瘤患者5年生存率仅为30%～40%[3]。因此，寻找能够有效抑制骨肉瘤原发灶转移的治疗方法，对于控制骨肉瘤的发生发展至关重要。

红景天甙(salidroside, Sal)是提取自中草药红景天根茎中的天然提取物。大量研究证实[4]，Sal具有广泛的生物学功能，如抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、增强免疫功能、双向调节中枢神经系统以及修复和保护机体等。尤其是在抗肿瘤方面，Sal能够有效抑制胃癌细胞增值并诱导其凋亡[5]。此外，Sal作用于肝癌细胞后，同样能够发挥抑制细胞增殖的作用[6]。然而，Sal对骨肉瘤细胞系增殖以及上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用目前尚无报道。因此，本研究拟通过观察Sal对骨肉瘤细胞系增殖、凋亡以及EMT的影响，初步探究其作用机制，以期为骨肉瘤的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：骨肉瘤细胞系HOS和U2OS细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。

1.1.2 试剂及试剂盒：红景天甙(南京格尔狄生物科技有限公司)；MTT试剂(北京索莱宝科技有限公司)；Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京碧云天生物技术公司)；抗Bcl-2、Bak、β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Slug及Snial抗体(Cell Signaling Technology公司)；Transwell小室(上海生博生物医药科技有限公司)；LY294002(Santa Cruz公司)；RPMI1640和胎牛血清等细胞培养试剂(上海生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与处理：将HOS和U2OS细胞均培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，且在培养基中加入1%的青霉素-链霉素。加入培养基后细胞于37 ℃、5% CO2条件下培养。当细胞汇合度达到80%左右时，更换新的RPMI 1640培养基。随后用50, 100 以及150 μmol/L的Sal处理细胞24 h。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖：待HOS和U2OS细胞增殖至80%左右时，以3×104个/mL的细胞加至96孔板，每孔150 μL。在各个细胞孔中加入不同浓度的Sal，每组均设3个复孔，并在细胞培养箱中继续培养24 h。随后在各孔中分别加入15 μL的MTT试剂，继续培养4 h后加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。最后于酶标仪490 nm处检测各孔的吸光度值，并计算细胞活性。

1.2.3 流式细胞计量术检测细胞凋亡：收集经过Sal处理后的HOS和U2OS细胞。用含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗固定细胞，并于1 000 r/min离心10 min。随后用100 μL 上样缓冲液重悬细胞，并充分振荡混匀。混匀后加入10 μL annexin V-FITC和10 μL的聚酰亚胺(polyimide，PI)溶液，37 ℃避光反应15 min后加入50 μg/mL的碘化丙啶进行染色。最后于流式细胞仪上进行检测。

1.2.4 Transwell小室法检测迁移：基质凝胶用RPMI 1640培养基稀释后，取40 μL加入至Transwell小室中，涂抹均匀后孵育24 h。第2天，将含无血清培养基的HOS和U2OS细胞加至上层Transwell小室中，下层加入含10%胎牛血清的培养基。孵育24 h后细胞于无水乙醇中固定，并加入苏木精-伊红染色(HE) 15 min。最后在倒置显微镜下，对进入滤膜下表面的细胞进行计数，以评估细胞迁移能力。

1.2.5 细胞划痕实验：将长势良好的HOS以及和U2OS细胞(8×104个/孔)接种于6孔培养板，培养24 h。当细胞增殖至95%左右时，每个孔都用200 μL无菌移液器枪头进行划伤。吸去悬浮的细胞并用PBS清洗2遍，随后加入150 μmol/L的Sal 37 ℃孵育24 h。拍下图片后，利用ImageJ软件分析了每条划痕两边缘之间的距离。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达：收集经Sal处理后HOS和U2OS的细胞，加入细胞裂解液后4 ℃反应30 min，6 000 r/min离心30 min后收集上清。BCA法检测蛋白浓度后，取10 μL蛋白进行SDS-PAGE分离，并于电转膜仪中进行转膜。转膜完成后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，随后加入相应的一抗4 ℃孵育过夜，再加入稀释好的二抗室温孵育2 h。抗体孵育完成后加入ECL发光液，并于显影仪中进行显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Sal抑制HOS和U2OS细胞增殖

用50、100 或150 μmol/L Sal处理24 h后，HOS和U2OS细胞的活力均显著降低，且与Sal的刺激剂量呈正比(图1)。

*P<0.05 compared with 0 μmol/L group图1 Sal对HOS和U2OS细胞增殖的影响Fig 1 Effects of salidroside on the proliferation of HOS and U2OS n=3)

2.2 Sal诱导HOS和U2OS细胞凋亡

不同浓度Sal处理48 h后，HOS和U2OS细胞的凋亡率显著增高(图2A，表1)。而Sal处理的HOS和U2OS细胞中同时存在Bcl-2表达的降低，以及Bak表达增高(图2B)。

2.3 Sal抑制HOS和U2OS细胞侵袭与迁移

不同浓度Sal处理24 h后，能够显著减少HOS和U2OS细胞的迁移水平(图3A)。Sal处理HOS或U2OS细胞后，细胞侵袭率均明显降低(图3B)。

2.4 Sal抑制PI3K/Akt通路，抑制EMT分子表达

用不同浓度Sal处理后，Akt磷酸化水平明显降低(图4A)。用150 μmol/L Sal处理后，HOS和U2OS 细胞中均出现EMT相关分子E-cadherin表达上调，N-cadherin、Slug和Snial表达下调。PI3K/Akt抑制剂处理细胞后的结果显示，与Sal单独处理的细胞相比，20 μmol/L PI3K/Akt抑制剂LY294002处理的HOS和U2OS 细胞中E-cadherin表达水平显著降低，而N-cadherin、Slug和Snial的表达水平有所增高(图4B)。

表1 Sal对HOS和U2OS细胞凋亡率的影响

3 讨论

Sal是草本植物红景天的主要成分，具有抗肿瘤、抗氧化等生物学活性，是目前抗肿瘤药物研究的热点之一。本研究通过检测HOS和U2OS细胞的细胞活性以及凋亡水平，证实了Sal对骨肉瘤HOS和U2OS细胞增殖的抑制作用，以及诱导细胞凋亡作用。

肿瘤转移涉及细胞的多种生物学功能，其中就包括侵袭与迁移。而细胞的侵袭与迁移往往也是恶性肿瘤从原组织向邻近的宿主组织扩散、转移的关键[7-8]。研究表明[9]，Sal可通过下调STAT3下游靶蛋白MMP2及MMP9的表达水平，进而抑制人结肠癌SW116细胞的侵袭及转移过程。本研究通过检测细胞的侵袭与迁移情况。结果显示，其侵袭与迁移水平受到明显抑制。进一步证实Sal可以抑制肿瘤细胞的侵袭与迁移。

A.HOS and U2OS apoptosis was detected by flow cytometry; B.expression levels of apoptotic proteins in HOS and U2OS cells were detected by Western blot; *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group

肿瘤细胞转移扩散至其他组织器官除了涉及细胞的侵袭与迁移过程外，通常还与细胞的EMT过程密切相关[10]。EMT的主要特征包括细胞黏附分子(如E-cadherin)表达的减少， EMT相关转录调控因子(Slug和Snial)表达增加[11]。此外，大量研究证实[12]， 肿瘤细胞发生EMT不仅能够增强肿瘤细胞侵袭的作用，而且还能显著增强肿瘤细胞的抗凋亡作用。本研究通过Sal处理HOS和U2OS 细胞后，细胞内E-cadherin表达上调，N-cadherin、Slug和Snial表达下调，提示细胞EMT受抑制。而由于EMT的抑制将直接影响细胞的增殖，这就可以解释为什么Sal对HOS和U2OS 细胞增殖也存在抑制作用。

A.invasion level of HOS and U2OS cells(×40); B.Migration level of HOS and U2OS cells(×100); *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group; #P<0.05 compared with the 24 hours group

A.level of Akt in HOS and U2OS cells was detected by Western blot; B.levels of EMT related molecules in HOS and U2OS cells was detected by Western blot; *P<0.05 compared with the 0 μmol/L group; #P<0.05 compared with the 150 μmol/L Sal group

PI3K/Akt是一种重要的胞内磷脂酰肌醇激酶，能够参与多种细胞生理活动的调控[13]。采用其抑制剂处理细胞，结果发现HOS和U2OS 细胞EMT水平显著降低，充分说明Sal抑制骨肉瘤细胞EMT过程与PI3K/Akt通路抑制有关。但是其具体通过哪些上游分子发挥作用，尚不清楚，仍需进一步明确。

综上所述，本研究初步证实Sal能够显著抑制骨肉瘤HOS以及U2OS 细胞的增殖、侵袭以及迁移能力，并诱导细胞发生凋亡。此外，其还能够通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制骨肉瘤HOS以及U2OS细胞发生EMT。这为进一步明确骨肉瘤的转移机制，从而开发有效的治疗药物提供了实验依据。