铜绿假单胞菌转录因子PsrA全局调控研究进展

李婵婵， 王 茹， 罗文英

（广东医科大学附属医院，广东 湛江 524001）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是引起院内感染主要的革兰阴性杆菌，为人体最重要的条件致病菌之一，可引起机体多系统、多脏器和多部位的感染。2015年全国细菌耐药性监测网对全国1 338所医院上报的非重复细菌调查发现：革兰阴性菌中PA位居第三，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。如此高的耐药率，主要与它的生物膜形成有关。PA能产生多种致病物质，主要是内毒素、外毒素、蛋白分解酶和杀白组胞素，其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力降低时，如大面积烧伤、长期使用免疫抑制剂等。临床上常见的有皮肤和皮下组织感染以及中耳炎、脑膜炎，呼吸道感染、尿道感染和血流感染等。

PA的生物膜、毒力及其生长受多个基因调控，信号通路复杂。有研究发现，TetR家族中细菌PsrA转录因子是其中重要的因素[2]，参与了PA侵袭、附着、蜂动能力与毒力因素的调节。TetR家族是细菌适应环境的一种机制，主要通过TetR转录因子的抑制或激活调控基因表达，进而控制自身对于不同外部条件的适应[3]，大多数细菌的转录因子PsrA含有2个结构域：一个是接受信号的结构域，另一个是DNA结合的结构域[4]。本文就PA转录因子PsrA的致病机制进行综述，以期为开发有针对性的药物提供理论依据。

1 长链脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）通过PsrA调控生物膜和毒力因子释放

1.1 PA通过肺泡活性物质获取营养，利用外源LCFA作为碳源适应肺部生长环境

1.1.1 PA对于LCFA的趋向性 PA对相应长度的LCFA（如油酸）具有明显的趋向性。PA的进化系统十分复杂，有鞭毛的PA可以在液体中移动，菌毛则可以帮助PA在固体表面（琼脂或人体组织）上滑动和蠕动[5]。有鞭毛的PA可以利用Ⅳ型菌毛（type Ⅳ pili，T4P），通过菌毛附肢的延伸，附着在固体基质上，通过回缩有效地帮助细菌穿过固体表面，T4P还参与各种功能，包括微菌落形成、生物膜启动和远程电子转移。

有研究发现，鞭毛和T4P在相应的液体或固体中运动，往往有其各自的趋向性（如氧张力、pH和特定的化学物质），磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱是PA运动的趋化剂。在营养采集、生物膜和毒力形成过程中，PA都展现了T4P趋向LCFA的作用[5]。另一方面，在PA感染的人支气管肺泡灌洗液的脱落细胞提取物中，各种独立的分离物也同样表现出对磷脂酰乙醇胺的诱导趋化性。

1.1.2 PA的外源性LCFA来源 肺泡活性物质是PA重要的外源性LCFA来源。哺乳动物的肺被肺表面活性剂包裹，该表面活性剂由大约10%的蛋白质和90%的脂质组成，其中大约80%的肺表面活性剂的脂质为磷脂酰胆碱[6]。PA产生磷脂酶C和脂肪酶，可以将外源磷脂酰胆碱分解为3种成分：磷酸胆碱头基、甘油和2个LCFA[7]。而肺部囊性纤维化过程中，PA通过获取磷脂酰胆碱进行代谢生长，达到很高的细胞密度，具体过程为：通过细菌磷脂酶C和脂肪酶对磷脂酰胆碱进行酶切，释放出磷酸胆碱的头基、甘油分子和2个LCFA。目前已鉴定出5种潜在的脂肪酸降解的操纵子（相关fadBA-操纵子fadBA1～5）[8]。这一脂肪酸降解途径是通过外膜转运蛋白FadL和内膜相关的CoA连接酶对LCFA进行跨细胞膜转运。在摄取LCFA后，LCFA有2个去向：一是通过β-氧化途径降解，并通过三羧酸循环成为能源/碳源；二是作为膜磷脂生物合成的前体[6]。在细菌磷脂酶C和脂肪酶对磷脂酰胆碱进行的酶促裂解释放的3种成分中，LCFA被高度还原，并产生最多的碳和能量。在PA庞大的毒力因子库中，大多数仅在高细胞密度复制过程中表达，且受喹诺酮信号调控[6]。因此，肺泡活性物质不仅可作为PA的趋化剂，还为PA生长提供碳源，与PA的生物膜、毒力因子生成有关。

1.2 LCFA通过PsrA调控fadBA5 β-氧化操纵子、RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon的表达

1.2.1 PA PsrA响应LCFA的信号调节fadBA5 β-氧化操纵子 有研究发现，在感染PA的急性肺炎小鼠模型中，鞘氨醇和磷脂酰胆碱都发挥了重要的作用，其中磷脂酰胆碱组分LCFA的降解可能通过3种不同的β-氧化途径发生，涉及3个fadBA操纵子（fadAB1-PA1737和PA1736、fadAB4-PA4786和PA4785、fadBA5-PA3014和PA3013）[9]。其中，fadBA5操纵子对LCFA信号有反应，在PsrA存在的条件下可被LCFA诱导，使LCFA与PsrA结合，进而抑制fadBA5[10]。

为了使外源脂肪酸能在PA内被降解，必须首先通过膜转运蛋白将其转运到细胞内，然后通过脂肪酰基辅酶A合成酶在三磷酸腺苷和辅酶A的参与下活化脂肪酸。活化的脂肪酸可进入β-氧化途径。在不存在脂肪酸的情况下，转录因子FadR会抑制编码β-氧化所需酶（FadL、FadD、FadE和FadBA）的基因[11]。

1.2.2 LCFA通过PsrA调控RpoS和Ⅲ型分泌物exsCEBA-Operon 在小鼠感染模型中，PA发挥感染、毒力作用最强的为Ⅲ型分泌系统（type Ⅲsecretion system，TTSS）。TTSS是一种专门的蛋白质分泌装置，由25个以上的基因编码，在被激活时，TTSS分泌效应分子进入宿主细胞的细胞质中，导致靶细胞功能障碍或死亡[12]。

TTSS和效应基因由转录因子ExsA结合其共有序列（TNAAAANA）大约50个碱基而被激活[13]。调控蛋白ExsD是一种抗激活剂、负调节剂，可与ExsA结合并阻止其激活TTSS基因转录。蛋白ExsC通过直接结合ExsD，阻断ExsD与ExsA作用[13]。当TTSS通道关闭时，ExsE与ExsC结合，但是有信号激活时，ExsE可被分泌到胞外，从而使ExsC可以自由地与ExsD相互作用并释放ExsA，最后ExsA激活TTSS表达[13]。然而，除ExsD外，蛋白ExsA、ExsC和ExsE的基因都位于同一个操纵子exsCEBA中[14]。

exsCEBA启动子的活性决定了exsCEBA对TTSS具有重要的调控作用。而PsrA可以与exsCEBA启动子结合。有研究发现，PsrA是exsCEBA以及TTSS效应子（如exoS）完整表达的必要条件[14]。DNA结合研究结果证实，LCFA抑制了PsrA与rpos和exsC启动子区域结合，LCFA通过PsrA直接影响这2个基因的激活[14]，且这种影响在细菌培养的整个对数期均保持较高水平。存在LCFA的情况下，PsrA-LCFA复合物使PsrA脱离exsC和rpoS基因的启动子，exsC和rpoS表达下降。

大量的毒力决定因子（LasA/LasB蛋白酶、碱性蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶、外毒素A、Ⅲ型切片外酶S/T/U/Y、鼠李糖脂、藻酸盐和氰化氢合成等）与PA的TTSS有关[15]。而细菌获得营养对细菌毒力因子的形成非常重要，因为细菌的毒力表达和营养物获得（如碳源）之间存在相互作用，获得营养是毒力因子产生的前提。肺泡表面活性物质作为一种外源LCFA来源，是细菌生长的重要营养物质，在PA生长中起重要作用。PA通过PsrA的表达直接利用肺泡表面活性物质影响毒力因子的生成。

2 PsrA调控PA耐药性及生物膜的形成

2.1 PA通过PsrA对阳离子型抗菌肽（cationic intrinsically disordered antimicrobial peptide，CIDAMP）的诱导，参与内在多黏菌素和抗菌肽抗性

2.1.1 CIDAMP的结构 抗菌肽作为重要的先天免疫剂，存在于植物、昆虫与哺乳动物体内。因此，抗菌肽被越来越多地用作前瞻性抗菌药物的模板，也被称为CIDAMP。它们的特征在于具有正净电荷及适度长度，并具有良好的水溶性。阳离子型抗微生物肽会结合并穿透细菌细胞膜，通过物理破坏，导致细菌细胞膜裂解，最终导致细菌细胞死亡，可替代常规抗菌药物。这些CIDAMP的优势在于：（1）与人宿主的两性离子哺乳动物膜相比，它们对带负电荷的细胞膜具有高度选择性；（2）由于肽通过物理作用破坏细胞而发挥功能，因此在靶向方面没有特异性膜，一般不会引起细菌耐药[16]。

有研究发现，有些氨基酸残基会促进有序蛋白变成结构混乱的无序蛋白，即使在包含了促进蛋白质结构无序化的氨基酸实验中，线性阳离子肽都是有效的杀菌剂，因此该离子肽效应与氨基酸序列无关[16]。这些CIDAMP的抗菌活性取决于肽链长度、净电荷、脂化作用和环境条件，影响病程发展的简单氨基酸序列，或者几乎天然存在的氨基酸序列都可以刺激产生大量的CIDAMP[17]。这些是针对PA、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和真菌等各种细菌病原体的潜在的新型抗菌药物。

2.1.2 CIDAMP 具有正常皮肤的健康人很少发生PA感染，PA的潜在抗菌肽来源可能是内分泌汗腺，这些汗腺产生了汗液特异性抗菌肽皮肤铁蛋白[17]。有研究发现，CIDAMP是高效的PA靶向肽抗菌药物，并且对人体具有较低的细胞毒性。PA的psra基因是对阳离子抗微生物剂的抗性和毒力特征的重要调节剂，介导阳离子肽抗性和某些与毒力相关的过程，如生物膜形成、快速附着和成群运动[18]。

多黏菌素是治疗耐药性PA最后的选择[19]，而psra转录可以调节抗菌肽的激活，对内在的抗菌肽和多黏菌素B抗性形成都有贡献。在psra突变体中，PA外膜的通透性改变，加强聚阳离子分子（如多黏菌素B和抗菌肽）透过外膜进入胞内。具体过程为：聚阳离子分子与膜上脂多糖的二价阳离子结合位点相互作用[20]，导致膜发生渗透损伤而摄入大量的聚阳离子分子，而多黏菌素B和抗菌肽被证实在psra突变体中渗透更高[18]。

2.2 PsrA通过调节LexA蛋白来介导1类整合子整合酶基因的表达

2.2.1 LexA蛋白与1类整合子 LexA是调节细菌应激反应途径的阻遏蛋白，能在不同种类细菌之间转录调控，调控细菌对抗菌药物的耐药性。应激情况下，LexA蛋白可被水解，使应激反应性基因被抑制。LexA失活的菌体对抗菌药物的耐药性显著降低，并且对传统的抗菌药物也高度敏感[21]，RpoS和PsrA蛋白在LexA蛋白质对整合酶转录的调控中起到调节作用。

PA在进化过程中存在信息交流行为[22]，1类整合子能在细菌间快速传播，被认为是影响抗菌药物抗性基因编码的重要因素[23]。在整合子的快速传播作用下，多重耐药PA在临床环境中有增加的趋势，几乎50%的多重耐药PA携带整合子。根据intI基因序列的差异，整合子分为几个不同的类别，第1～3类是重要的可移动元件，主要通过质粒或转座子传播。整合子中的基因让PA获得了β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素、磺胺类、甲氧苄啶、红霉素、喹诺酮类、磷霉素、季铵化合物防腐剂和其他临床常用抗菌药物的抗性。

2.2.2 细菌通过PsrA影响RpoS调节LexA蛋白与intI基因表达 细菌经常暴露在不稳定的环境中，通过各种基因表达使自身达到与环境相适应的状态。暴露于多种环境压力下，还可能产生有毒化合物，这些化合物可能对细菌本身有害。因此，PA产生了一套适应和克服外部和内部有害影响的机制。在刺激性环境中，应激系统会被激活，以维持基因组完整性，并维持PA较好的生长状态。 LexA蛋白可通过对RNA聚合酶的变构干扰来抑制细菌的应激反应。当感染PA时，应激系统被激活，LexA蛋白水解失活和intI1基因表达被激活。RpoS是这些应激反应的中心调节因子，主要监管机构是PsrA，而PsrA主要通过影响调节信号——喹诺酮信号来影响RpoS的形成[21]。

2.3 PA PsrA通过喹诺酮信号调控生物膜形成

细菌生物膜的细胞外聚合物质可作为基质将细菌细胞保持在一起。PA的细胞外聚合物生物膜是多糖、核酸和蛋白质的混合物。生物膜发育不同阶段的多糖合成位点（胞外多糖Psl）的产物肉眼可见，在附着过程中，胞外多糖Ps1以螺旋状锚定在细胞表面，促进细胞间的相互作用和基质的形成，生成的基质将细菌保留在生物膜中。在生物膜成熟过程中，胞外多糖Psl会积聚在微菌落的外围，从而在微菌落中心形成无Psl基质的空腔。在分散阶段，活动力强的细胞、死细胞和细胞外DNA被释放到空腔中进行播散[24]，进而成为PA生物膜形成的机制——建立基质，然后形成1个空腔，最后释放细胞播散[25]。

PA拥有一个复杂的群体感应（quorum sensing，QS）网络，该网络由4个系统组成，控制着细菌的相互作用和毒力因素的表达，如毒力因子、成群的运动力和生物膜。其中喹诺酮信号系统生成PA喹诺酮信号（Pseudomonas aeruginosaquinolone signal，PQS），通过激活pqsABCDE操纵子形成正反馈回路，生成更多的PQS[26-27]。

PQS生物合成首先由一种邻氨基苯甲酸辅酶—A PqsA连接酶开始[28]。PqsA通过CoA收集邻氨基苯甲酸以形成茴香酰-CoA，丙二酰-CoA通过PqsD的作用，被PqsB和PqsC催化与辛酰基辅酶A结合形成2-庚基-4-喹诺酮[29-30]。最后单加氧酶PqsH催化2-庚基-4-喹诺酮形成PQS。有研究发现，PsrA通过脂肪酸β-氧化途径，抑制PA0506的转录，进而正向影响PQS产生，使得酰基辅酶A化合物向烯酰辅酶A化合物的转化减少，从而允许部分辛酰辅酶A逃脱β-氧化途径并形成PQS[31]。

PQS除作为QS信号分子发挥作用外，还可介导铁吸收，与生物膜、细胞毒性、外膜囊泡有关[32]。PsrA在影响PQS形成的同时，也影响了PA生物膜的形成[33]。

3 结论与展望

PsrA不但与PA的生物膜形成有关，还与其耐药性、细胞毒性、主动免疫活动有关。一般情况下，PsrA能以协作的方式发挥作用，使其立即参与免疫保护和营养获取。PsrA的产生可能会改变细菌种群的整个结构，从而提高其在多种环境中的适应性，并建立起对环境压力的抵抗力。此外，我们推测PsrA仍然存在未知的功能，因此有必要进行更多的研究，以探索PsrA在开发现代生物技术和治疗传染病方面的潜在应用。